高效液相色谱法测定过瘤胃赖氨酸盐酸盐的含量

赵 威，徐振兴，吴月敏，吴丽艳，于思婷，徐二华，王 效

（1.杭州康德权饲料有限公司，杭州 311107; 2.包膜饲料添加剂省级重点企业研究院，杭州 311107）

赖氨酸作为“第一缺乏氨基酸”，在生物体内的代谢起着重要的作用，而被广泛用于食品、医药及饲料等工业。饲料中添加赖氨酸可提高蛋白质的利用率，强化饲料营养，易于动物消化吸收，增加料肉比[1]。由于赖氨酸易吸潮，因而在实际生产中都以赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐形式加以利用，以便于贮存、运输与使用。

反刍动物同样需要赖氨酸，若直接添加晶体氨基酸，在瘤胃内会发生脱氨基作用达不到添加效果，而且会增加粪氮、尿氮排放[2]。若将氨基酸包膜，使氨基酸能通过瘤胃不被破坏，不仅能提高反刍动物生产性能，还能降低日粮蛋白水平，减少粪氮、尿氮排放，提高生产效益。

目前赖氨酸盐酸盐的检测方法有高氯酸滴定法[3，4]、凯氏定氮法、甲醛加入滴定法[5]及衍生法液相色谱测定等方法[6]。在我国，现行的行业和国家检测标准（NY39－87和GB10794－2009），所采用的方法是非水滴定法，其中用到的试剂有：高氯酸滴定液、冰醋酸溶液、乙酸汞溶液，上述试剂或腐蚀性强，或为剧毒试剂，不但不易获得而且其操作对环境不友好，不利于大批量产品的质量控制。而液相色谱检测方法能进行批量检测，检测数据稳定可靠，样品为色谱分离检测，相比滴定法所受的干扰较小。本研究建立了高效液相色谱法测定过瘤胃赖氨酸盐酸盐含量的方法，为过瘤胃赖氨酸盐酸盐质量标准的建立和产品质量控制提供依据。

1 仪器与试药

赛默飞 U3000高效液相色谱仪（备有紫外检测器）；变色龙6.8色谱工作站。

L-赖氨酸盐酸盐标准品（MACKLIN，批号：C10429138）；过瘤胃赖氨酸盐酸盐样品（杭州康德权饲料有限公司提供，批号为190516、190518、190520）。

2 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：Agela Technologies，Venusil MP C18（4.6×150mm,5µm）；流动相：乙腈∶0.017mol/L庚烷磺酸钠溶液（取1.7g庚烷磺酸钠置于500mL量瓶中，加入0.1mLH3PO4，用纯水稀释并定容至刻度）=15:85，进样量20µL，检测波长195nm；流速1mL/min。此色谱条件下，由赖氨酸盐酸盐对照品溶液和供试品溶液分析可知，出峰时间一致，均为3.68min，且溶剂无干扰。

在上述色谱条件下分别取对照品溶液、供试样品溶液和阴性对照溶液各20µL进样分析，结果表明：理论板数按赖氨酸盐酸盐计算不低于4000，色谱峰分离度良好。对照品、供试样品和阴性对照溶液色谱图见图1。

图1 对照品、供试样品和阴性对照溶液色谱图

3 方法与结果

3．1 溶液制备

对照品溶液：精密称取对照品赖氨酸盐酸盐0.25g，置100mL量瓶中，加超纯水约20mL溶解，用超纯水定容至刻度，摇匀，制每1mL含赖氨酸盐酸盐约2.5mg的对照品溶液。

供试样品溶液：称取50%过瘤胃赖氨酸盐酸盐样品约0.1g，精密称定，置于100mL容量瓶中，加超纯水约50mL，置于100℃沸水中水浴煮沸约5min，取出放冷至室温，加超纯水定容至刻度，摇匀，备用。

3．2 线性关系考察

分别精密量取赖氨酸盐酸盐对照品溶液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，分别置于10mL量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，分别得赖氨酸盐酸盐浓度为0.025、0.125、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mg/mL的溶液，分别进样20µL测定。以对照品溶液浓度（X，mg/mL）为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，赖氨酸盐酸盐回归曲线方程为：Y=22.663X+0.1964（r2=0.9997）。赖氨酸盐酸盐在0.025～1.25mg/mL范围内，与峰面积成良好线性关系。

3．3 精密度试验

取对照品溶液在上述色谱条件下连续进样6次，峰面积的RSD结果为：0.06%。

3．4 重复性试验

取同一批号的50%过瘤胃赖氨酸盐酸盐6份，批号为190516，每份取样品约0.1g，精密称定，按3.1方法操作。在上述色谱条件下进样分析，结果赖氨酸盐酸盐的平均含量为50.52%，RSD为0.03%，表明重复性良好。

3．5 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12h，在上述色谱条件下进样分析，计算赖氨酸盐酸盐峰面积的RSD，结果为0.35%。结果表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

3．6 回收率试验

取已知含量的过瘤胃赖氨酸盐酸盐9份，批号为190516，每份取粉末约0.1g，精密称定，分别精密加入低、中、高3种浓度的对照品溶液，同上法操作，在上述色谱条件下分析，计算平均回收率。加样回收率测定结果见表1。

3．7 样品测定

精密称取50%过瘤胃赖氨酸盐酸盐样品约0.1g，置于100mL量瓶中，按3.1项下的方法操作，在上述色谱条件下对3批次过瘤胃赖氨酸盐酸盐进行分析，计算含量，结果见表2。

表1 回收率试验结果

表2 50%过瘤胃赖氨酸盐酸盐样品测定结果（n=3）

3．8 检出限与定量限

图2 检出限（C）、定量限（D）液相色谱图

取赖氨酸盐酸盐对照品适量，加超纯水溶解并稀释制成一系列浓度的溶液，取20µL注入液相色谱仪，测得赖氨酸盐酸盐最小检出限为0.25µg（S/N≥3），定量限为2.5µg（S/N≥10）。检出限和定量限色谱图见图2。

3．9 方法的比较

取3批次样品，分别采用高氯酸滴定的国标法与本液相法检测，结果本法含量平均值为50.42%，RSD为0.02%，高氯酸滴定法平均值为50.43%，RSD为0.05%（表3）。检测结果表明，本法与高氯酸检测结果一致，无显著差异。

表3 样品测定比较

4 讨论

4．1 流动相和波长的选择

陆淳等[7]用高效液相色谱法测定饲料级赖氨酸盐酸盐，以pH1.5的水为流动相，检测波长为195nm，结果该方法在紧邻样品主峰前有个小的未知峰出现，会影响色谱峰积分，且色谱柱长时间用水做流动相对柱效也会产生影响。由于赖氨酸盐酸盐含有盐酸根离子，故本研究的流动相尝试使用离子对试剂，选择了庚烷磺酸钠磷酸溶液和乙腈配比的流动相；当用紫外分光光度计对样品溶液在190～300nm处进行波长扫描时发现，检测波长在195nm左右时有最大吸收峰，故检测波长选择195nm。最终，以离子对试剂的乙腈溶液作为流动相，在195nm的波长下，样品溶液色谱峰出峰正常，色谱峰的前后1min均无明显未知峰出现，避免了干扰，提高了色谱峰积分的准确性和重现性。

4．2 溶剂的选择

赖氨酸盐酸盐易溶于水[8]，样品溶剂分别选用了流动相和水，发现流动相溶解的样品色谱图分离不好，峰型不对称，而直接用水溶解的样品峰型对称，分离效果好。故采用水作为样品溶剂。

4．3 样品前处理方法选择

过瘤胃赖氨酸盐酸盐样品选择了棕榈油为主要包膜材料，由于样品外层包裹了一层油脂，直接超声不能溶解样品，故需要在沸水浴中加热至样品溶液中颗粒物全部融化成透明液体，大约需要2min时间。这样赖氨酸盐酸盐才能充分从包膜材料中释放出来，溶解到溶剂中，经冷却后定容，即可上机测定。

本研究建立了高效液相色谱法测定赖氨酸盐酸盐的分析方法，使用的溶剂为水，方法快速、准确、重复性好，可作为赖氨酸盐酸盐的质量控制方法。