氧化石墨烯对紫花苜蓿种子萌发与幼苗生长的影响

(天津师范大学生命科学学院,天津 300387)

近年来，随着科技的发展，纳米材料被广泛应用。纳米材料具有接触反应活性、量子尺寸效应、表面效应、电传导性等特有的物理化学性质，因其在自然环境中可能对动植物生长繁育、生态环境稳定及社会安全等方面产生的负面影响而受到广泛关注[1]。最初人们发现暴露在富勒烯水溶液中的鲈鱼脑中产生脂质过氧化现象[2]，之后关于纳米材料的生物毒理效应的研究愈发深入。纳米材料对生物体的毒理效应会成为生态毒理学研究的一个重要方向[3]。

石墨烯(Graphene)是一种由碳原子以sp2杂化方式形成的蜂窝状单层二维平面结构纳米材料，最初由英国曼切斯特大学的科研人员采用机械剥离法从石墨中分离出来单层石墨微片[4]。氧化石墨烯是石墨烯的氧化产物，相比石墨烯性质更活泼，已广泛应用于医药、电磁、光学、能源、传感器以及材料学等多个领域，在其生产加工、使用及回收处理等过程中，氧化石墨烯不可避免地进入大气、土壤、水环境中，对动植物造成影响。关于纳米材料对植物生长发育的研究已有一些报道[5-6]，氧化石墨烯与其他碳纳米材料对植物细胞影响的研究也有相当的进展[7-9]，然而关于氧化石墨烯对于紫花苜蓿的影响研究仍待开展。

紫花苜蓿是我国主要牧草之一，也是历史最长、种植面积最大、需求最多的牧草[10]，优质紫花苜蓿的干草蛋白质含量可达18%，粗蛋白消化率为70%，是可消化蛋白质最高的牧草之一。紫花苜蓿适应性强，不同气候环境中它都能较好地生长繁殖。我们选用紫花苜蓿作为实验对象，探究土壤中氧化石墨烯的含量对紫花苜蓿的萌发以及早期生长的影响，旨在揭示氧化石墨烯对豆科植物的生长繁育的调控规律与作用机制，进一步的揭示纳米材料对动植物生物毒理效应以及可能存在的其他潜在风险，为纳米材料的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料

氧化石墨烯购自苏州恒球纳米公司，外观为黑褐色粉末，厚度为3.4～8 mm，片层直径10～50μm，层数5～10层，纯度95%；比表面积100～300 m2·g-1。

实验用土壤取自天津师范大学校园内表层0～20 cm土壤，风干后过筛备用。土壤为砂质粘土，pH 7.51，含水量17.89%，容重0.68 g·cm-3，孔隙度74.34%。

紫花苜蓿购自北京正道种业有限公司。

1.2 紫花苜蓿培植

采用上直径23 cm、下直径17 cm、高18 cm的塑料花盆，每盆中加入2.5 kg土壤，氧化石墨烯按0.5%、1.0%和1.5%比例加入，混匀，以不加氧化石墨烯(0%)为对照(ck)，每个处理3次重复。将100粒紫花苜蓿种子均匀撒入花盆中，稍微覆土并喷洒适量水，在发芽前进行遮光处理，并保证水分充足，以满足植物萌发所需。在子叶完全展开后，每天调换位置以保证光照一致。植物培养期间室内温度为18～25 ℃，相对湿度为30%～60%，光照为透入室内的自然光。

1.3 指标测定

1.3.1种子萌发

播种后第2天开始陆续萌发，每天统计发芽数，连续观察至第5天萌发情况趋于稳定，至第7天记录完毕。评价种子萌发情况参数为：发芽势(GE)、萌发率(GP)、萌发速率系数(CGR)、萌发指数(GI)。

计算公式：

GE(%)=(萌发4 d内发芽种子数/供试种子总数)×100%；

GP(%)=(n/N)×100%；式中：n和N分别为萌发种子数和试验过程中所用种子总数；

CGR=[∑(t·n)/ ∑n]×100;式中：t为自萌发试验开始时的天数，n为在t天内萌发的种子数;

GI =∑(Gt/Dt);式中：Gt为时间t天的萌发种子数，Dt为萌发试验天数。

1.3.2株高动态

从第10天长出第1片真叶后，每盆随机选取5株紫花苜蓿并取其平均株高。持续测定10 d，最后一天的植物株高为最终株高。

1.4 数据处理

紫花苜蓿种子萌发及株高动态生长效应评价采用隶属函数法[11]，公式如下：

R(Xj)=(Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin)

式中，R为隶属函数值，Xj为第j个综合指标，Xmax、Xmin分别为第j个综合指标的最大值和最小值。然后用各指标的隶属函数值相加来计算综合评定值。

采用SPSS 20.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Turkey法进行数据差异显著性检验(p<0.05)；采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 氧化石墨烯对紫花苜蓿种子萌发的影响

氧化石墨烯对紫花苜蓿种子萌发的影响如表1所示。随着土壤中添加氧化石墨烯比例的增加，紫花苜蓿种子的萌发势、萌发率呈先增加后减少的趋势，但是差异并不显著；种子萌发速率指数表现出明显的递减趋势，说明氧化石墨烯延长了紫花苜蓿的种子萌发时间；从萌发指数来看，氧化石墨烯提高了种子萌发指数，随氧化石墨烯比例增加呈先升高后降低的趋势，1.0%处理组的种子萌发指数最大，显著高于对照组。

2.2 氧化石墨烯对紫花苜蓿幼苗株高的影响

紫花苜蓿幼苗株高生长情况如表2所示。可以看出，氧化石墨烯含量越高，对幼苗的生长越不利，且随着幼苗的生长发育，这种抑制表现得愈发显著。在18 d之前，0.5%处理与对照组株高差异不显著，在19、20 d，氧化石墨烯处理显著低于对照，且随氧化石墨烯添加比例的增加而降低。

表2 氧化石墨烯对紫花苜蓿株高动态的影响

表3 氧化石墨烯对紫花苜蓿指标影响的隶属函数分析

表1 氧化石墨烯对紫花苜蓿种子萌发的影响

注：不同小写字母表示不同处理差异显著(p<0.05)。下同。

20 d的幼苗株高如图1所示。0.5%、1.0%和1.5%处理的幼苗株高和对照相比，分别降低10.96%、32.69%和48.08%，差异显著。

图1 氧化石墨烯对紫花苜蓿20d株高的影响

2.3 氧化石墨烯对紫花苜蓿萌发与幼苗生长影响效应的评价

采用隶属函数法对土壤中添加不同比例氧化石墨烯对紫花苜蓿种子萌发与幼苗生长的影响进行评定(表3)。结果表明，1.0%处理组的紫花苜蓿，相对其他处理生长情况最好，排名第一，0.5%与1.5%处理的种子萌发与幼苗生长状况明显劣于对照，综合评定排名为：1.0%、ck、1.5%、0.5%处理。

3 讨论与结论

豆科植物的幼苗期是与根瘤菌建立共生关系的重要时期，根瘤侵染植物根系形成根瘤的过程需要植物为其提供养分[12]，而植物幼苗的生长情况直接关系到植物养分状况。对于紫花苜蓿来说，萌发与初期生长对植物后期生长繁育极为重要。实验表明，氧化石墨烯使紫花苜蓿种子萌发速率变慢，但是萌发指数更高，相对来说种子活力更高。总体来说，1.0%氧化石墨烯处理的种子萌发生长效果最好，对于种子活力提升较大。He等研究认为，氧化石墨烯的亲水性与水传输性被用于促进植物的萌发与生长，氧化石墨烯收集水并将水运输到种子处以加速种子的萌发，进而提高了种子活力[13]。Yin等发现，氧化石墨烯促进种子萌发与幼苗生长，同时，氧化石墨烯可以吸附基质中的重金属，从而使得水稻的生长受到正面的影响[14]。此外，Hu等发现，氧化石墨烯能够提升老化种子的活力，种子的萌发率提高了15%[15]。

虽然种子萌发指数得到提升，但氧化石墨烯并未显著影响萌发势和萌发率。种子的萌发需要满足多个条件，水分、光照、氧气和温度等[16]，种子的年龄也影响着种子的萌发[17]。综合认为，种子的水分条件与土壤中氧化石墨烯含量相关，这直接影响了种子的萌发。另外，氧化石墨烯的生物毒性也需要考虑[19]。本研究表明，紫花苜蓿种子的萌发良好，说明实验条件适合种子萌发，而种子萌发率、萌发势没有受到显著影响，可能是种子本身的特性影响所致。

研究发现，低浓度的石墨烯或氧化石墨烯促进植物的生长发育而高浓度抑制[20-21]。但是紫花苜蓿相对其他植物，抗逆性更高，能够在更苛刻的条件下生长，可能萌发率与萌发势并不会因为外界条件改变而发生太多的变化。汪玉洁等研究认为，纳米材料侵入种子并在种皮附近聚集，种皮遭到破坏，对于一些植物来说这促进了种子萌发[22]；而紫花苜蓿的种皮与番茄或水稻等种子不同，它更厚实坚韧，这种差异可能造成紫花苜蓿种子萌发速率变慢。

氧化石墨烯处理显著降低了紫花苜蓿的株高，且随着时间推移差距愈发明显。王晓静等研究认为，氧化石墨烯对高羊茅株高的影响是先增加后减少的[23]；吴金海等研究也表明，氧化石墨烯对油菜的萌发与生长有着显著的正面作用[24]；Yin等研究认为，单独的氧化石墨烯处理会抑制玉米的生长[14]。与上述研究不同的是，Zhao等关于氧化石墨烯对拟南芥影响的研究发现，氧化石墨烯对拟南芥幼苗的萌发，根、芽的生长，花、种子的发育并没有明显影响[25]。研究结果显示，紫花苜蓿的萌发与幼苗生长受氧化石墨烯的影响，但是这种影响与之前的研究结果有所不同，可能的原因是氧化石墨烯对植物生长发育的影响对于单独的某一种植物来说取决于植物本身。

隶属函数分析是一种在多指标测定基础上对植物萌发和生长进行综合评价的方法，从而避免了单一指标的片面性，提高评价的准确性，能更好地揭示植物的生长状况；隶属函数值越大，表明该剂量的氧化石墨烯对种子萌发和幼苗生长的促进作用越明显[26]。本研究表明，1.0%的隶属函数值最大，其次为对照，1.5%和0.5%处理则次之。

综上所述，土壤中添加氧化石墨烯使紫花苜蓿种子的萌发速率变慢，提高了萌发指数，未显著影响萌发率与萌发势；氧化石墨烯显著抑制了幼苗的生长，且随着添加比例的增加和时间推移而加大。采用隶属函数进行综合评定，结果为添加1.0%的氧化石墨烯处理表现最好。