红细胞溶血法用于体外评价日化产品和原料刺激性的研究

俞 婕 祝 愿 鲍红洁

（纳爱斯集团有限公司，浙江丽水，323000）

兔眼刺激性实验（Draize Eye Test）是评价化妆品、化学原料等刺激性大小的经典方法。但该方法也有其不可避免的局限性，包括评分主观性强，以及会对动物的眼睛造成伤害[1]。为了弥补这些不足，国内外越来越多的机构开始研究体外快速评价日化产品和原料刺激性的方法。

红细胞溶血实验（Red Blood Cell Lysis Assay）就此应运而生，作为替代兔眼刺激性测试的体外方法之一，该方法具有快速、重复性好等优势。国内外众多实验室已开展对红细胞溶血测试方法的建立及其代替眼刺激性实验的可行性研究，并且已经积累了一定的研究经验。不过，目前大部分的研究主要集中在该方法结果与兔眼刺激性结果的比较上[2-3]，或是对红细胞溶血测试方法的机理研究上，而很少有机构单纯将该方法应用于日化产品和原料的刺激性测评。

本研究旨在建立红细胞溶血法快速评价和对比日化产品和原料的刺激性，为日化产品开发中的原料筛选、配方优化等过程提供快捷、有效的体外评价方法。

1 材料与方法

1.1 样品

选取27个日化产品以及表面活性剂原料作为红细胞溶血实验的测试样品。其中样品的PBS溶液应为无色澄清且均匀的液体，溶液现配现用，避免放置过久产生沉淀或分层。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

梅特勒ME3002E电子天平（精确至0.0001 g），湘仪H1850高速离心机，IKA KS400 ic控温摇床，Thermo Fisher全波长酶标仪及配套96孔板，一恒HWS26型恒温水浴锅，Eppendorf移液器（1～10 mL，100～1000 μL，1～100 μL）。

1.2.2 试剂

无菌脱纤维绵羊血，购自索莱宝（Solarbio），4℃下保存，自生产之日起一个月内使用。PBS缓冲液：NaCl 7.20 g，KH2PO40.76 g，Na2HPO4·12H2O 7.95 g，葡萄糖 1.80 g，加蒸馏水定容至1 L，调节pH至7.2～7.4。SDS溶液：称取适量十二烷基硫酸钠（分析纯），加蒸馏水配制成指定浓度。

1.3 红细胞溶血实验方法

1.3.1 红细胞悬液的制备

将5 mL新鲜的无菌脱纤维绵羊血移入50 mL离心管中，加入40 mL 37℃水浴的PBS缓冲液，3800 r/min离心15 min[4]，小心移除上清液和白细胞层，再次加入PBS缓冲液并重复操作至少3次，直至上清液澄清透明。最后加入PBS缓冲液稀释，使其在575 nm处的吸光度值约为2[4]，即可用于测试。

红细胞悬液需现配现用，配制当天需置于4℃冰箱内保存备用，使用前需充分混匀红细胞悬液，以避免红细胞悬液上下层之间浓度不均匀。

1.3.2 全溶血对照组的选择

有文献报道将蒸馏水组作为全溶血对照组，而将SDS溶液作为阳性对照组[5]，也有报道将SDS溶液作为全溶血对照组[6]。由于全溶血对照组的数据直接影响到后续的结果统计和计算，本文对全溶血对照组进行测试以备选择。

分别将配置好的红细胞悬液以1:1的比例与浓度分别为20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L的SDS溶液进行溶血实验，并测量反应终止后各测试组在560 nm处的吸光度值，根据结果判断溶血情况。

1.3.3 红细胞溶血实验

选择PBS缓冲液作为溶剂，将测试样品配制成指定浓度，用100 mL容量瓶定容。浓度设计：预实验设5个左右不同浓度点来确定HC50的浓度范围。正式实验时根据预实验的结果设置至少8个不同浓度，且至少要有两个点覆盖HC50附近相关浓度，以避免太多的无溶血和全溶血浓度。

将不同浓度测试样品溶液与红细胞悬液以1∶1体积混合，并于32℃，200 r/min转速下振荡10 min。振荡结束后10000 r/min离心1 min以终止反应。小心吸取上清液200 μL于96孔板上（避免产生气泡），用酶标仪测试560 nm处的吸光度值，每管样品3孔平行，剔除异常数据后取平均值。除测试样品外，以PBS为自溶血对照组，并根据1.3.2的实验结果选择适宜的全溶血对照组。

1.3.4 评价方法

通过观察和比较50%红细胞发生溶血时的样品浓度HC50来横向比较测试样品刺激性大小，HC50的数值越大，对应样品的刺激性越小，反之如果HC50的数值越小，则对应样品的刺激性越大。

HC50的计算：先计算样品溶液每个浓度的溶血率，计算公式如下：

其中A1、A2、A3分别为测试样品组、自溶血对照组、全溶血对照组在560 nm处的吸光度值。以样品浓度为横坐标，溶血率为纵坐标作直线回归，根据直线回归方程计算导致50%红细胞溶血时的样品溶液浓度，即HC50值（单位mg/L表示），结果保留整数。

2 实验结果

2.1 全溶血对照组的选择

根据初步实验判断出当SDS溶液浓度100 mg/L及以上时，红细胞已经达到全溶血状态。随后对SDS溶液浓度梯度进行细化（图1），实验证明当SDS溶液的浓度≥50 mg/L时，560 nm处的吸光度值基本持平，说明此时红细胞已达到全溶血状态。根据此结果，并充分考虑实验批次之间的误差，本实验后续选取100 mg/L SDS溶液作为全溶血对照组。

2.2 日化产品的红细胞溶血实验

图1 不同浓度SDS溶液的红细胞溶血结果

选择了3类刺激性关注度较高的婴幼儿日化产品进行红细胞溶血实验，分别是婴儿洗发泡泡、婴儿洗发沐浴露、婴幼儿洗衣液，每一类产品选取了4～6个配方进行比较。通过HC50值可以看出，不同类型产品之间的刺激性整体存在差异，其中婴儿洗发泡泡和婴儿洗发沐浴露由于直接与婴儿柔嫩的皮肤接触，配方的刺激性整体比婴幼儿洗衣液更低。同一类产品中，不同配方之间也能进行刺激性大小的比较。更进一步，在同一个配方中，比较了4种原料对配方的刺激性带来的差异（洗发泡泡配方PP1（原料A-D）），其中选用原料A时配方的刺激性略大于其他3种原料。

2.3 表面活性剂的红细胞溶血实验

选择了12种日化产品中常用的表面活性剂原料进行红细胞溶血实验。比较HC50值可以发现不同表面活性剂之间的刺激性大小存在差异，如月桂酰谷氨酸钠的HC50值明显大于其他表面活性剂，说明其刺激性较小。AES的HC50值最小，说明其刺激性相对较大。

2.4 结论

实验验证了采用100 mg/L的SDS溶液作为全溶血对照组在红细胞溶血实验中的可行性。在对婴幼儿日化产品的红细胞溶血实验中，通过比较各样品的HC50值，能有效评价和对比不同品类日化产品的配方在刺激性大小方面的差异，也能区分和比较同一品类产品中不同配方之间的差异，还能为产品研发过程中的配方筛选和优化提供有效的数据支持。在对表面活性剂原料的测试中，不同样品之间的HC50值差异较为明显，有一定的区分度，能够为配方研发过程中的原料选择提供一定的参考。

3 讨论

国内外关于红细胞溶血法的研究可追溯至30多年前[7]，虽然实验原理和实验过程基本一致，但各家机构所采用的红细胞种类、统计方法等实验条件各有不同，很难判断出一个最优的方案。对于评价血红蛋白变性的计算方法而言，目前报道的就有2种[4,8]甚至更多，而且也没有具体说明各计算方法的原理。因此，红细胞溶血实验目前只能更多地应用于自身实验室范围内。

表1 日化产品的红细胞溶血结果

表2 表面活性剂原料的红细胞溶血结果

对于红细胞溶血实验评价日化产品和原料的刺激性的方法，现有资料大多是测试并计算得出半数红细胞溶血浓度HC50与血红蛋白变性率HDR（或血红蛋白变性指数DI）的比值H/D，根据比值对测试样品进行“无刺激、微弱刺激、轻度刺激、严重刺激”4个级别的评价。但在日化产品和表面活性剂原料的测试中，大部分的刺激性等级处于“无刺激性”或“轻度刺激性”水平，无法进行更为细致地区分和比较，因而也无法给予产品开发过程中的表面活性剂原料筛选、配方横向比较等提供有效的参考。而通过测试和比较样品的HC50，既能够区分相同刺激性等级下不同样品之间细微的刺激性差异，也可以节省更多测试和计算时间，提高产品研发的效率。

当然，红细胞溶血法由于实验材料、计算方式等因素，也有着一定的局限性。一是对于带有颜色或浑浊的样品溶液会干扰最终的吸光度测试结果，此类产品或原料无法进行准确地测试。二是不同的红细胞来源也会影响实验的准确性和重复性[9-11]，因此在实验室范围内最好选择单一且稳定的血液来源，以便对各批次测试结果进行比较。另外，对于测试血液要求在自生产之日起的4周进行使用，尽量不使用过期的血液产品，以避免血液的自溶血过高引起结果的变化。

研究还发现，日化产品或是表面活性剂原料的HC50值常常在较为狭窄的浓度区间内产生突跃，此时可能需要经过多次预实验才能锁定HC50的浓度范围，再根据测试情况进行浓度梯度设计。