补坎益离丹慢性毒性初步研究

霍艳颖，王梦婕，李 佳，姜代勋*，霍桂桃

(1. 北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206；2. 中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，北京 100176)

随着中国家庭宠物饲养条件的改善和兽医诊疗水平的提高，犬等动物的寿命得到很大提高。伴随着犬老龄化的到来，犬心脏病的发病率大幅度升高，病犬主要表现出精神沉郁、食欲不振、咳嗽、呼吸困难、运动耐力降低、牙龈苍白等症状。目前宠物诊疗机构主要应用多种西药以减轻心脏负荷、增强心肌收缩力来缓解症状，宠物临床上可供使用、有效治疗犬心脏病的中药方剂少之又少。

补坎益离丹是清末名医郑钦安为治疗心病不安所设，主要用于心阳不足等心病的治疗，至今对人心脏病仍有良好的治疗作用[1-3]。中国历来存在医方人畜通用，医理人畜互参的比较医学体系。将补坎益离丹用于犬等动物心阳虚证的治疗和研究将扩大该经典方剂的应用范围。因该方剂中含有附子和桂心，传统医学认为二者均具有一定的毒性。本研究以小鼠为模型，研究补坎益离丹对其血常规、血生化指标及五脏组织细胞结构的影响，以确保补坎益离丹在犬等动物心阳虚证应用上的安全性，具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物(昆明小鼠60只，雌雄各半，24～26 g)及饲料均由斯贝福生物技术有限公司提供，许可证号分别为：SCXK(京)2016-0002、SCXK(京)2015-0015。试验在清洁级环境中进行，室温27 ℃，相对湿度40%～70%，自然光线。饮用水为经高压灭菌的自来水。小鼠采食、饮水不限。

1.2 主要试剂

附子、桂心、炙甘草、蛤粉购于北京同仁堂药店大栅栏总店，生姜购于北京农学院家属院便民商店，生化17项测试盒、血常规试剂盒购于爱德士生物科技公司，苏木素伊红染色试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，其他试剂等购于北京化学试剂公司。

1.3 补坎益离丹的制备

补坎益离丹为清末名医郑钦安所创，包括附子八钱，桂心八钱，蛤粉五钱，炙甘草四钱，生姜5片。清朝一钱相当于现在的3.72 g，该方可换算成：附子30 g，桂心30 g，蛤粉19 g，炙甘草15 g，生姜5片(约60 g)。所有药材在煎煮前浸泡30 min，将浸泡后的附子(制)放入砂锅加入适量的蒸馏水，煎煮1 h。随后加入桂心、蛤粉、炙甘草、生姜。先武火煮沸后，再文火煎1 h，倒出煎液。加入适量热水进行二煎，文火再煎1 h，倒出煎液。合并2次煎液，浓缩至所需浓度。

1.4 慢性毒性试验

昆明小鼠60只，雌雄各半，随机平均分为空白组、低剂量组和高剂量组。适应性饲养5 d后，空白组每日灌胃生理盐水0.5 ml、低剂量组每日灌胃0.1 g/mL补坎益离丹0.5 mL、高剂量组每日灌胃0.5 g/mL补坎益离丹0.5 mL，连续60 d。以50 kg成人体重为标准，补坎益离丹低剂量组相当于人常规用药量，高剂量组相当于人常规用药量的5倍。随后各组小鼠摘眼球取血，IDEXX ProCyte Dx Hematology Analyzer检测血常规指标，IDEXX Catalyst One Analyzer检测血生化指标。取血后将小鼠脱椎处死，摘取肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏于4%多聚甲醛固定，常规方法制作组织切片。

1.5 统计分析

数据以平均值±偏差表示，采用t-检验分析空白组与低剂量组、高剂量组差异显著性。低剂量组、高剂量组与空白组比较，*表示差异显著(P<0.05)。

2 结 果

2.1 临床观察

各组小鼠用药期间被毛整洁，皮肤颜色正常，进食、饮水及生长状况良好，对外界反应灵敏，未见异常分泌物等。试验过程中，死亡7只小鼠。其中，空白组分别在第35天、第42天各死亡1只，低剂量组分别在第25天、第49天各死亡1只，高剂量组分别在第11天、第37天、第53天各死亡1只。

2.2 血常规指标结果

低剂量组、高剂量组与空白组比较，血常规主要指标如红细胞数量、红细胞比容、白细胞数量、中性粒细胞数量、淋巴细胞数量、单核细胞数量、血小板数量及血小板压积等均未见明显变化，差异不显著(P>0.05)。低剂量组与空白组比较，平均红细胞体积、网织红细胞百分比、网织红细胞显著降低(P<0.05)，而嗜酸性粒细胞百分比显著升高(P<0.05)。高剂量组与空白组比较，平均红细胞体积、网织红细胞百分比、平均血小板体积、血小板分布宽度显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 小鼠血常规指标Tab.1 Results of blood routine indexes in mice

2.3 生化指标结果

低剂量组、高剂量组与空白组比较，除低剂量组小鼠的尿素显著高于空白组，存在显著差异(P<0.05)外，其他生化指标均无显著变化(P>0.05)，见表2。

表2 小鼠血生化指标Tab.2 Result of blood biochemical indexes in mice

2.4 组织切片

低剂量组、高剂量组与空白组比较，心脏心肌细胞均排列整齐、细胞核清晰完整、心肌纤维完整无断裂；脾脏红髓、白髓结构完整，无炎性细胞浸润；肺脏肺泡囊、肺泡管均结构完整，无炎性细胞浸润；肾脏肾小体、肾小管结构均完整，无炎性细胞浸润；肝脏肝细胞排列整齐、细胞核清晰完整，无炎性细胞浸润，见图1。

3 讨 论

血常规是临床最普遍的检查方法之一[4-6]，是指通过观察血细胞的数量变化、形态分布以判断血液状况、辅助疾病诊断。血常规中的具体指标可敏感反映机体多种病理变化，其中以白细胞数、红细胞数、血红蛋白和血小板比较具有诊断价值。另外，血常规还是观察药物疗效、副作用等常用参考指标。由于小鼠血液量少、易凝固，在检测时一些样品出现不同程度凝固，导致可统计的样本量较少，但仍有一定的参考价值。低剂量、高剂量连续给予小鼠60 d后，血常规主要指标如白细胞数、红细胞数、血红蛋白及血小板等均没有发生明显改变，提示补坎益离丹长期应用对主要血细胞没有不良影响。低剂量组、高剂量组平均红细胞体积虽显著降低，但与空白组比较下降幅度约为1/10，可忽略其影响；网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，在周围血液中的数值可反映骨髓红细胞的生成功能，低剂量组、高剂量组网织红细胞百分比、网织红细胞均明显降低，虽提示红细胞的生成减少，但红细胞数跟空白组比较没有发生显著变化；低剂量组嗜酸性粒细胞百分比虽显著升高，而嗜酸性粒细胞数则没有升高的变化。高剂量组平均血小板体积明显下降提示血小板生成不良，血小板分布宽度降低表明血小板的均一性高，而高剂量组血小板数跟空白组比较没有异常变化。因未见公认的小鼠血常规指标参考值范围，若参考犬的血常规相关指标正常变动区间范围，则以上小鼠异常变化的血常规指标均应在正常范围内。

血生化检测是为临床提供诊断、评价药物作用的重要方法[7-9]，包括检测血液中的糖类、酶类、离子、蛋白、脂类、代谢产物以及激素等。低剂量组、高剂量组用药后，除低剂量组的尿素水平显著升高外，主要生化指标均无显著差异。血中尿素主要经肾小球滤过，通过尿液排出体外，当肾小球受损时滤过率降低，血中尿素升高。尿素是反映肾小球滤过功能的重要指标。低剂量组的尿素含量仅高于对照组约1/5，临床意义不大。提示补坎益离丹长期应用对主要血生化指标没有明显不良影响。

石蜡切片不仅用于观察正常组织细胞的形态结构，也是病理学、药理学等研究疾病或药物影响组织细胞形态变化的重要方法[10-12]。组织器官经过固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤能清晰辨认其细胞结构。与空白组比较，低剂量组、高剂量组肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏均无明显变化。提示补坎益离丹长期应用对肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏组织细胞结构没有不良影响。

空白组死亡2只小鼠，低剂量组死亡2只小鼠，高剂量组死亡3只小鼠。小鼠死亡后经解剖发现肺脏均出现不同程度的充血或实变，而其他脏器无肉眼可见的变化。小鼠死亡原因可能与长期灌胃造成气管、肺部的损伤或操作失误导致死亡有关。

低剂量、高剂量在长期给药的情况下，对小鼠临床表现、血常规主要指标、血生化指标及五脏组织结构均没有不良影响，表明含有附子、桂心的补坎益离丹安全性良好，可为犬等宠物临床用药研究提供参考。