不同产地板蓝根药材中(R,S)-告依春含量测定与分析

孟文文，钟昆芮，周艳飞，王亚芳*，董 虹*

(1.北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206；2.北京市兽药监察所，北京 102629)

板蓝根(Isatidis Radix)为十字花科(Cruciferrae)植物菘蓝(IsatisindigoticaFort.)的干燥根，为中国传统中药，具有清热解毒、凉血和抗病毒的功效，临床常用于发热发斑、风热感冒、咽喉肿烂、腮腺炎等[1-2]。研究表明，板蓝根具有抗菌、抗病毒以及抗内毒素的功效，能增强动物机体的抵抗力，现已广泛用于抗病毒、抗感染类兽药的生产与合成[3]。由于其抗病毒疗效显著，且适应性强，中国南北地区都有种植[4]。不同地区生产的板蓝根有效成分含量差异较大，药材质量参差不齐。(R,S)-告依春(又名表告依春)是板蓝根的主要抗病毒成分[5]，板蓝根药材中(R,S)-告依春含量的高低，能较好反应药材质量情况。本试验通过测定不同产地(R,S)-告依春的含量，并调查不同产地的纬度、温度、降水、日照时间等自然条件，以阐明产地因素对其有效成分含量的影响，为合理选择板蓝根种植区域提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器及药品

高效液相色谱仪(Waters公司，型号e 2695)；检测器(Waters公司，型号2998 PDA)；HC-C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm，Agilent公司)；分析天平(Mettler Toledo公司，型号XP 205)；离心机(赛默飞世尔公司，型号Heraeus Pico 17)；超纯水仪(默克密理博Elix公司)。

(R,S)-告依春对照品(中国食品药品检定研究院，编号111753-201706，含量100%)；甲醇(色谱级，赛默飞世尔公司)；超纯水；磷酸(色谱级，赛默飞世尔公司)。10批次的板蓝根药材来源见表1。不同产地的主要生态因子见表2，数据来源于人地系统主题数据库。

表1 板蓝根药材产地及来源Tab.1 Origin and source of Isatidis Radix

表2 各产地主要生态因子Tab.2 Main ecological factors of each producing area

注：本数据来源于人地系统主题数据库。

Note: This data comes from the human system topic database.

1.2 试验方法

色谱条件：色谱柱为Agilent HC-C18(2)色谱柱；流动相为甲醇-0.02%磷酸溶液(7∶93)，流速为1.0 mL/min；检测波长为245 nm；进样量为10 μL。

对照品溶液制备：取(R,S)-告依春对照品10 mg，精密称定至250 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL含对照品40 μg的对照品溶液，摇匀，即得。

供试品制备：取板蓝根药材，制成粉末(过0.3 mm筛)，精密称定约1 g置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL超纯水，称定重量，煎煮2 h，放至室温，再称定重量，用超纯水补足减失的重量，摇匀，静置5 min，吸取上清液，13 000 r/min离心6 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

1.3 方法学研究

线性关系考察：取(R,S)-告依春对照品适量，精密称定置容量瓶中，加甲醇分别制成每1 mL含5、10、20、40、80 μg的溶液。在1.2色谱条件下，分别精密吸取10 μL对照品溶液注入液相色谱仪，测定峰面积；并以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

精密度试验：精密吸取40 μg/mL的对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，在1.2色谱条件下连续进样6次。测定(R,S)-告依春峰面积并计算其相对标准偏差(RSD)。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，在1.2色谱条件下，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h分别进样，测定(R,S)-告依春峰面积并计算RSD值。

重复性试验：取同一批板蓝根药材，连续制备6份供试品溶液，在1.2色谱条件下，测定(R,S)-告依春平均含量并计算其RSD值。

回收率试验：采用加样回收法，取同一批次板蓝根药材，其含量为0.366 mg/g，精密称定5份，分别精密加入(R,S)-告依春对照品适量，在1.2色谱条件下进行测定，计算其平均回收率及RSD值。

1.4 样品含量测定

按1.2的供试品制备方法分别对5个不同产地共10批板蓝根药材进行处理，制成供试品溶液，并按1.2色谱条件对(R,S)-告依春进行含量测定，每批样品平行测定2份，以外标法计算(R,S)-告依春含量。

1.5 数据分析

采用GraphPad Prism 5软件对试验数据进行方差分析与多组间比较。

2 结果与分析

2.1 方法学研究

线性关系考察结果显示，其回归方程为Y=65 327X-439.25，R2=1.0000，表明(R,S)-告依春在5～80 μg范围内线性关系良好。

精密度试验结果显示，其对照品峰面积的RSD为0.24%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验结果显示，(R,S)-告依春含量在0～24 h内RSD为1.88%，表明供试品在24 h内稳定。

重复性试验结果显示，(R,S)-告依春含量平均值为0.21 mg/g，RSD为2.48%，表明本试验重复性良好。

回收率试验结果显示，其平均回收率为100.82%，RSD为2.54%，表明此检测方法准确度良好。具体数据见表3。

表3 (R,S)-告依春加样回收率Tab.3 (R, S)-goitrin sample recovery rate

2.2 (R,S)-告依春含量与分析

对照品与供试品色谱图见图1。如图2所示，5个产地的板蓝根药材中(R,S)-告依春含量范围在0.197～0.590 mg/g之间，其中河北和山东地区含量较高，分别为0.590 mg/g和0.481 mg/g，其次为甘肃、东北和安徽地区，分别为0.375 mg/g、0.263 mg/g和0.197 mg/g，安徽所产的含量最低。其中河北和山东地区与甘肃、东北以及安徽地区的(R,S)-告依春含量均存在极显著差异(P<0.001)。不同产地所产的板蓝根有效成分差异显著，说明产地因素会对药材的质量品质产生影响。

2.3 不同产地板蓝根药材HPLC图谱分析

由图3可以看出，不同产地板蓝根药材HPLC图谱有很大差异，这种差异不仅表现在各有效成分的含量差异，还表现在有效成分的种类差异。如13～15 min保留时间内，河北与山东产地均含有3个物质峰，而甘肃、东北以及安徽产地仅有1个或2个物质峰。说明生长在不同地区的板蓝根药材，其有效成分的累积确实会受到产地因素影响。

3 讨 论

本试验考察各产地生态因子对板蓝根有效成分含量的影响，所选取的生态因子均为影响其有效成分含量的主要生态因子。板蓝根适应性较强，对气候的要求并不严格，其习性喜湿暖，能耐寒、忌高温、怕水涝，中国南北地区均可种植[6]。比较各地的生态因子，其中河北和山东地区年平均气温分别为10.2 ℃和12.1 ℃，年降水量分别为681.3 mm和654.4 mm，其气候温暖，降水量丰富的特点与板蓝根的生长习性较为符合，且其有效成分含量也较高，是较为适宜的种植区域；甘肃地区虽温度较为适宜，但可能因降水量较低(年降水量为326.5 mm)，气候较为干燥，不利于土壤水分积累以及植物的生长，因此其有效成分含量较河北地区低，是适宜的种植区域；东北地区近年来产量较大，成为板蓝根的主产区，但因其气候较为寒冷，年平均气温仅为4.0 ℃，与板蓝根喜温暖的习性较不相符，其有效成分含量较低，适宜性较差；安徽地区的年平均温度和年降水量分别为14.8 ℃和960.4 mm，是5个产地中最高，与板蓝根忌高温，怕水涝的习性较为不符，其有效成分含量较低，适应性较差。

图1 对照品(A)与供试品(B)色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substance (A) and test sample (B)

注：ns表示无显著差异(P>0.5)，*表示差异显著(P<0.05)，***表示差异极显著(P<0.001)。Note: ns indicates no significant difference (P>0.5), * indicates significant difference (P<0.05), *** indicates that the difference is extremely significant (P<0.001).图2 各产地板蓝根的(R,S)-告依春含量差异Fig.2 Differences in (R,S)-goitrin content of Isatidis Radix from each producing area

板蓝根成分复杂，且含有多种有效成分。板蓝根中的总生物碱具有抗炎、抗病毒、解热的作用[7]，其中(R,S)-告依春为板蓝根的主要抗病毒成分[5,8-9]，因此本试验以(R,S)-告依春的含量作为评价指标，能较好反映板蓝根药材质量的高低。

目前，板蓝根尚无一致的公认道地药材，对其道地产区一直存在争议，有文献记载河北省为道地产区，但具体地区并不明确[7]。除河北、河南、安徽、陕西等几个形成较早的老产区以外，黑龙江、内蒙古、甘肃等地有较大面积种植[10]。不同区域生产的板蓝根药材的有效成分含量差异很大，并会直接影响其质量品质以及临床药效。施峰等[2]比较不同产地的板蓝根中水杨酸含量的差异，不同产地的板蓝根药材中水杨酸含量差别较大，安徽亳州产的比安徽阜阳产的高4倍多；吴国学[7]比较不同产地板蓝根中有效成分表告依春的含量差异，河北省板蓝根内表告依春含量最高，其次为安徽阜阳和黑龙江大庆，其余产地含量较低；胡晓燕等[10]比较20批不同产地的板蓝根药材中的表告依春含量，安徽、内蒙古以及黑龙江产区的含量较高，明显高于其他产区，河南以及甘肃产区的含量较低，均小于0.02%，且不符合《中国药典》的要求。产地因素确实能影响中药材的有效成分含量，并导致质量的差异。确立道地产区对于保障中药材的质量品质以及药效具有重要意义。本试验与吴国学[7]以及胡晓燕等[10]的结论不一致可能是所采集样本的批次不同所致，且板蓝根在全国范围内分布广泛，本研究仅对几个大产区的部分样品进行考察，要想进一步确立板蓝根的道地产区，应在更大范围内进行采集。本试验采用高效液相色谱法测定板蓝根中有效物质的含量，精密度高，重复性以及稳定性良好，可以用于(R,S)-告依春的含量测定，并为评价药材质量的高低提供参考。

注：A.河北；B:山东；C:甘肃；D:东北；E:安徽图3 不同产地板蓝根HPLC色谱图Fig.3 Isatidis Radix HPLC chromatogram from different origins

通过比较不同产地的生态因子，分析其对有效成分含量的影响，不同产地板蓝根质量差异较大，其生长、代谢以及有效物质的积累很大程度上受到产地温湿度、光照、土壤养分、水分等因素的影响[4]，从而导致不同产地板蓝根的有效成分含量差异明显。王玲娜等[11]比较分析产地生态因子对金银花活性的影响，海拔高度是影响绿原酸与木犀草苷的主导生态因子，随着海拔的升高，绿原酸与木犀草苷呈增加趋势。赵文龙等[6]采用最大熵模型计算各生态因子对板蓝根适应性的贡献率，最干季节降水、年平均气温、最湿季节均温是贡献率较高的3个生态因子。其结论与本文结论较为一致，可见产地的气温和降水因素是影响板蓝根生长和分布的主要生态因子。科学分析中药材的适生区域，并充分了解相关生态因子对其品质的影响规律，对保证药材质量品质以及药效具有重要意义。

不同产地的板蓝根中(R,S)-告依春含量差异较大，其中河北和山东产地含量较高，是板蓝根较为适宜的种植地区。比较各生态因子，其中气温和降水是影响其含量的主要生态因子。