小豆矮秆窄叶突变体转录组分析和激素应答反应

杜萌莹，李 蕊，阮国希，李奕松，万 平，杨 凯*

(北京农学院a.植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，b.生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室；北京 102206)

小豆(Vignaangularis)为一年生二倍体草本植物，是豆科、蝶形花亚科、菜豆族、豇豆属中的一个栽培种。小豆起源于中国，有悠久的栽培历史，具有较高的营养价值和经济价值[1-2]。中国拥有丰富的小豆种质资源，小豆基因组[3]的发布，为小豆的遗传学研究提供理论基础。

株型是作物最重要的农艺性状之一，理想株型是作物高产和优质的保障，株高和叶形是评价作物株型的重要指标。株高超过一定范围容易引起植株倒伏，影响单株产量，矮秆基因通过控制株高增强植株的抗倒伏性，使作物更适合机械化收割[4]。矮秆水稻和小麦的应用，产生“第一次绿色革命”[5]。叶片是作物重要的光合作用器官，也是影响株型形成的重要因素。矮化育种在提升作物抗倒伏能力和产量上的研究越来越多，阐明株型的遗传机制有助于作物性状改良。

研究表明，大多数矮化植株是由植物激素合成与信号转导通路相关基因突变导致的，赤霉素(GA)、生长素(IAA)、油菜素内酯(BR)、独脚金内酯(SL)、脱落酸(ABA)和乙烯(Eth)对植株的茎秆发育产生影响。其中，赤霉素调控植物茎秆发育的研究较多，主要以水稻、拟南芥及小麦的矮秆突变体为材料进行研究。目前，与赤霉素相关的矮秆突变体主要有两类，GA敏感型和GA不敏感型。水稻珂巴焦磷酸合成酶1(OsCPS1)、内根-贝壳杉烯合成酶1(OsKS1)、内-贝壳杉烯氧化酶(OsKO2)和内-贝壳杉烯酸氧化酶(OsKAO)突变体也有植株矮化表型，严重的伴有不结实现象[6]。DELLA蛋白是赤霉素调节通路的重要元件，拟南芥中鉴定出编码DELLA蛋白的基因有GAI、RGA、RGLl、RGL2和RGL3等，其突变体均表现株高变低、叶片浓绿等[7-8]。小麦的Rhtl、Rht2基因和大麦的slr基因编码DELLA蛋白，是GAI的同源基因，其突变体因不能形成GA-GID1复合体，致使赤霉素信号传导失败，植株表型异常[9-10]。

目前，有关矮秆遗传机理的研究主要集中于玉米、水稻、小麦、大豆等大宗作物，有关小豆株型的研究鲜见报道。随着高通量测序技术的发展，RNA-Seq被广泛用于生命科学研究，本研究对小豆野生型栽培小豆地方品种GM437和矮秆窄叶突变体nld的根、茎、叶进行转录组学分析(RNA-Seq)，以期探索小豆矮化分子机理，为小豆株型育种提供理论基础。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为小豆高秆野生型材料GM437和矮秆窄叶突变体nld，由北京农学院小豆课题组提供。小豆矮秆窄叶突变体nld由栽培种京农6经EMS诱变而成，经多年田间表型鉴定，nld突变体的矮秆窄叶表型稳定遗传。材料盆栽的方式种植于北京农学院试验温室，五叶期采集GM437和突变体nld的根、茎、叶材料，放入液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取和质量检测 使用Sigma GenEluteTM提取样品的总RNA，通过Nanodrop 2000进行RNA质量和浓度检测，琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，通过Qubit2.0对RNA浓度进行精确定量。

1.2.2 cDNA文库构建、测序 RNA-Seq文库，均由3株样本等量混匀而成，3次生物学重复。突变体nld的根、茎、叶样本文库分别为nld-root、nld-stem、nld-leaf，野生型材料GM437的根、茎、叶样本文库分别为GM437-root、GM437-stem、GM437-leaf。样品质量检测合格后，用Oligo(dT)磁珠对mRNA进行富集。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，反转录合成双链cDNA。利用AMPure XP beads纯化双链cDNA，末端修复加A尾并连接测序接头，片段大小选择后，构建cDNA文库，使用Qubit2.0质检后，通过Illumina高通量测序平台测序。

1.2.3 原始数据的组装 对测序所得原始数据进行过滤。数据过滤标准如下：过滤带有测序接头(adapter)的reads；过滤N(不确定碱基)含量比例大于10%的reads；过滤低质量碱基(Q≤5)含量大于50%的reads。统计Clean reads的数量、总长度、GC%等。使用Q30(碱基准确率达到99.9%)的质量控制标准。将过滤后数据与Yang等[3]的小豆参考基因组进行比对。

1.2.4 差异表达基因的筛选 TMM对筛选出的数据进行标准化处理后，DEGseq进行差异表达分析。DESeq使用基于负二项分布模型的算法，即第i个基因在第j个样本中的read count值为Kij，则有：Kij～NB(μij，σij2)。对差异基因进行筛选的阈值一般为：|log2(Fold Change)|>1且padj<0.05。

1.2.5 差异表达基因功能注释分析 通过DAVID软件对筛选的差异表达基因进行Gene Ontology(GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)富集分析，计算这些差异基因同GO分类中某几个特定分支的超几何分布关系，获得差异表达基因在GO中的显著富集类别。利用KEGG数据库对差异表达基因进行通路分析，统计每个通路中包含的差异表达基因的个数，通过超几何检验找出显著富集的通路。

1.2.6 外源激素处理 分别用40 mg/L赤霉素(GA3)、1 mg/L油菜素内酯(BRs)和1 mg/L生长素(NAA)溶液每天喷施盆栽小豆处理组茎、叶，对照组喷施蒸馏水，每组10株小豆幼苗，连续处理14 d，每天测量对照组和试验组各株材料的株高，拍照记录。外施激素14 d，正常管理，28 d后调查株高、茎粗、第一茎节间到第四茎节间的节间长和主茎节数。数据用Microsoft office Excel 2010进行统计分析。

2 结果及分析

2.1 RNA-Seq测序结果及分析

原始测序数据(Raw reads)平均值为29 563 694，去除接头序列及低质量序列后，获得的高质量测序数据(Clean reads)平均值为29 118 733，样品Q30平均值为93.61%，GC含量平均值为43.86%，说明测序质量符合要求，可用于后续分析。将高质量测序数据与参考序列进行比对，在6个样本组的高质量测序数据中，在参考序列上有唯一比对位置的序列占90.55%，有多个比对位置的序列占3.15%，总测序序列定位数占93.71%。结合以上数据可以说明转录组测序质量较高，符合进一步的生物信息学分析要求(表1)。

2.2 差异表达基因筛选

从两个材料的根部筛选出6 184差异表达基因(2 656个上调，3 528个下调)，茎部筛选出8 909差异表达基因(5 364个上调，3 545个下调)，叶部筛选出13 605个差异表达基因(10 587个上调，3 018个下调)。其中，在三个组织中均有差异表达的基因2 675个(图1)。

表1 测序数据量及质量统计Tab.1 Sequencing data and quality statistics

图1 野生型和突变体表达基因维恩图Fig.1 Venn map of gene expression from wild type and mutant

2.3 差异表达基因GO注释分析

差异表达基因的GO注释分为三类：生物过程、细胞组分和分子功能。经分析，根部的差异表达基因的生物过程主要集中在细胞碳水化合物代谢过程(GO:0044262)、细胞多糖代谢过程(GO:0033692)、葡聚糖代谢过程(GO:0044042)和细胞葡聚糖代谢过程(GO:0006073)，细胞组分主要为胞外区(GO:0005576)和非原质体(GO:0048046)，分子功能主要有ADP结合(GO:0043531)、细胞骨架蛋白结合(GO:0008092)和葡糖基转移酶活性(GO:0046527)(表2)。茎部的差异表达基因的注释较多，其中，生物过程主要集中在碳水化合物代谢过程(GO:0005975)、外层包被结构组织(GO:0045229)、细胞壁组织(GO:0071554)和葡聚糖代谢过程(GO:0044042)，细胞组分主要为胞外区(GO:0005576)和非原质体(GO:0048046)，分子功能主要有糖基转移酶活性(GO:0016757)和己糖基转移酶活性(GO:0016758)(表2)。叶部的差异表达基因注释较少，其中，生物过程主要集中在碳水化合物代谢过程(GO:0005975)，分子功能主要有己糖基转移酶活性(GO:0016758)和UDP-己糖基转移酶活性(GO:0008194)(表2)。

表2 差异表达基因GO注释Tab.2 GO annotation of differentially expressed genes

2.4 KEGG 通路分析

通过KEGG分析，发现根部的差异表达基因主要集中在苯丙烷生物合成通路(ko00940)、植物激素信号转导通路(ko04075)、ABC转运通路(ko02010)等(表3)。茎部的差异表达基因主要集中在植物激素信号转导通路(ko04075)、苯丙烷生物合成通路(ko00940)、植物病菌互作通路(ko04626)、淀粉与蔗糖代谢通路(ko00520)、类黄酮生物合成通路(ko00941)和植物MAPK信号通路(ko04016)等(表3)。叶部的差异表达基因主要集中在植物激素信号转导通路(ko04075)、碳代谢通路(ko01200)、淀粉与蔗糖代谢通路(ko00500)和苯丙烷生物合成通路(ko00940)等。根、茎、叶三种组织中差异基因的共有表达通路主要为苯丙烷生物合成通路(ko00940)、植物激素信号转导通路(ko04075)(表3)。

表3 差异表达基因KEGG富集Tab.3 KEGG enrichment of differentially expressed genes

2.5 矮秆窄叶表型相关的差异基因

突变体nld在苯丙烷生物合成通路中基因有较大的变化。关键基因4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、肉桂醇脱氢酶(CAD)在根、茎、叶中的表达有不同的变化。在根中，CAD表达量上调。在茎中，4CL、CAD和CCR表达量下调。在叶中，4CL、CAD和CCR表达量上调。总的来说，苯丙烷生物合成通路中的这三个关键基因在茎中表现为下调趋势。

突变体nld在赤霉素生物合成通路中的关键因子尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)、4-羟苯基丙酮酸双氧酶(HPD)、ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-CPS)在根、茎、叶组织中表达有不同程度的差异。在根中，仅有ent-CPS的表达量下调。在茎中，HPD、ent-CPS在突变体中表达量下调。在叶中，HPT和HPD的表达量下调。总的来讲，赤霉素合成通路的这三个关键基因在茎和叶中都有下调趋势。

2.6 激素调控分析

经1 mg/L油菜素内酯(BRs)和1 mg/L生长素(NAA)处理的两组材料，突变体和野生型茎秆的伸长和叶形的发育都没有明显变化(图2A，图2B)，表明矮秆窄叶突变体是一个油菜素内酯和生长素不敏感型突变体。在40 mg/L的赤霉素(GA3)作用下，突变体和野生型的茎秆显著伸长，叶形没有发生明显的变化(图2C)。外源赤霉素能够使矮秆突变体的茎秆发育缺陷得到一定程度的缓解，但并没有使突变体恢复至野生型表型，表明突变体是一个赤霉素弱敏感型突变体。

图2 突变体nld与野生型GM437材料外施激素后的表型变化(14 d)Fig.2 The phenotype change of mutant nld and wildtype GM437 treated with BRs, NAA, GA3 (14 d)

外施赤霉素后突变体nld株高、茎粗、茎节数极显著增加，第一茎节间长极显著增长，第二茎节间、第三茎节间长显著增长，赤霉素处理后的nld突变体第一茎节间到第三茎节间长均超过野生型GM437处理后的对应节间长，第一茎节间到第三茎节间长之和占株高的60%以上，赤霉素处理后主茎节数恢复到10节(表4)。表明赤霉素主要通过增加突变体的主茎节数和第一茎节间到第三茎节间长使其株高增加。野生型材料对赤霉素的响应更为强烈，茎节徒长，主茎节数较少(表4)。

表4 外源赤霉素处理的突变体nld和野生型GM437株高(28 d)Tab.4 The plant height of mutantnld and wild-type GM437 treated with exogenous GA3 (28 d)

注：表中数字为每组3株材料平均值±标准差；0.01

Note: Data are presented as means±SD(n=3)；Values of 0.01

3 讨 论

矮秆窄叶性状在水稻、玉米等作物的研究较多，在小豆中鲜见报道。小豆矮秆窄叶突变体转录组学研究对阐述小豆茎秆发育机理和小豆株型遗传改良具有重要意义。

差异表达基因GO分析表明小豆野生型和突变体的根、茎、叶差异表达基因均涉及碳水化合物代谢过程，同时，也有各自的特异性表达基因。其中，根部主要表现在糖类代谢过程，茎部为细胞壁发育过程，叶部为糖基转移过程，表明矮秆突变体由于各组织功能不同而发生组织特异性应答效应。本研究中，茎部注释到的GO分类最多，表明矮秆窄叶突变体的茎部基因表达变化最大，叶部次之。突变体茎的发育缺陷主要涉及碳水化合物代谢过程和细胞壁发育过程，叶片的发育缺陷主要与糖基转移酶的活性相关。外层包被结构组织(GO:0045229)、细胞壁组织(GO:0071554)也是植物茎部发育的重要通路。水稻矮秆和叶片早衰突变体del1和玉米矮秆材料Dwarf11的转录组学研究结果表明，差异表达基因主要集中在次生代谢产物生物合成与代谢、细胞壁生物合成等相关通路[11-12]。

在突变体茎中，苯丙烷生物合成通路中的关键基因4CL、CAD、CCR的表达均表现为下调趋势，已有研究表明，苯丙烷生物合成通路基因的突变影响茎秆和叶片的发育。苯丙烷生物合成通路中的关键基因C4H[13]、HCT[14]、C3’H[15]、CCR[16-17]等基因的突变影响木质素的合成，从而使突变体表现为矮秆表型，HCT，C3’H基因缺陷突变体的叶片发育受到影响。小豆nld突变体的突变机制与苯丙烷生物合成通路的关系尚需进一步的研究。

外源赤霉素作用下，突变体和野生型的株高增长达到极显著水平。赤霉素处理后nld突变体第一茎节间到第三茎节间长均超过野生型GM437处理后的对应节间长，第一茎节间到第三茎节间长之和占株高的60%以上，主茎节数恢复到10节。表明赤霉素主要通过增加突变体的主茎节数和第一茎节间到第三茎节间长使其株高增加。突变体对赤霉素的响应说明小豆株高变矮并不是由于体内赤霉素信号转导过程受阻所致，而是由于赤霉素含量较低。突变体在赤霉素作用下株高并没有完全恢复，叶形没有发生变化，与野生型对照相比，株型还是存在明显的差异。大豆矮小突变体的转录组学分析结果显示，差异表达基因与植物激素信号转导途径相关，并通过外施GA3使大豆矮小突变体的茎变高[18-19]。本研究中，生长素和油菜素内酯的作用对野生型和突变体材料并没有产生影响，说明突变体中生长素和油菜素内酯的合成没有缺陷。这些试验结果表明突变体中赤霉素的合成较少只是矮秆窄叶表型形成的原因之一，还有另一条途径影响小豆株型的建成。结合KEGG分析结果，可能是苯丙烷生物合成通路与植物激素信号转导通路同时调控小豆茎秆和叶形的发育，但其具体调控路径还需要进一步研究。

本研究通过对小豆栽培种野生型GM437和矮秆窄叶突变体nld进行转录组学分析，认为苯丙烷生物合成通路和植物激素信号转导通路可能为小豆茎秆矮化的主要调控通路，4CL、CAD、CCR、HPT、HPD等基因在小豆茎秆发育过程中起到重要作用。赤霉素对矮秆窄叶突变体的作用主要集中在小豆发育早期，对早期小豆茎节的生长和茎节的分化形成起到至关重要的作用。