陈源 潘鹤立 尤有利 吴玉华 潘东明 余文权
摘 要:探讨金柑果实发育过程中总酚含量、总黄酮含量及总酚酸含量的动态变化差异。以尤溪金柑品种金弹为试验材料,对不同生长发育期金柑果实中总酚含量、总黄酮含量及总酚酸含量进行检测分析。结果表明:随着成熟度的增加,花后55~65 d金柑果实中总黄酮含量和总酚酸含量随着成熟度的增加而急剧减少,花后85 d左右变化平缓,到接近成熟的花后125 d左右,黄酮含量和酚酸含量小幅上升后下降;果皮中的黄酮含量和酚酸含量大于果肉。金柑果实含有丰富的酚类物质,随着果实的生长发育呈现逐渐降低的趋势;金柑果实总酚与类黄酮含量呈显著正相关;金柑幼果比成熟果具有更高的酚类物质和更强的抗氧化能力。
关键词:金柑;果实;酚类物质;不同成熟期
中图分类号:S666 文献标志码:A 文章编号:0253-2301(2020)11-0007-05
DOI: 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.11.002
Abstract: The dynamic changes of total phenol content, total flavonoid content and total phenolic acid content in Fortunella crassifolia during the fruit development were studied. The contents of total phenols, total flavonoids and total phenolic acids in Fortunella crassifolia fruit at different growth stages were determined and analyzed by using the variety of kumquat in Youxi as the experimental material. The results showed that: the contents of total flavonoids and total phenolic acids in the fruit of kumquat decreased sharply with the increase of maturity at 55-65 days after flowering, and changed gently at around 85 days after flowering, and then at about 125 days after flowering, the flavonoid content and phenolic acid content increased slightly and then decreased after 125 days after flowering; The flavonoid content and phenolic acid content in the pericarp was higher than that in the flesh. The fruit of kumquat was rich in phenolic substance and it tended to decrease with the growth and development of the fruit. The content of total phenols and flavonoids in the fruit of kumquat was positively correlated. The young fruit of kumquat had higher phenolic substance and stronger antioxidant ability than the ripe fruit.
Key words: Fortunella crassifolia; Fruit; Phenolic substance; Different mature period
柑橘原產于我国,有4000多年的栽培历史。柑橘是世界第一大果树品种,种植面积和产量在世界百果中均居首位[1]。我国柑橘资源丰富,优良品种繁多,与其他水果相比,存在橘皮和种子等废料多的问题。柑橘加工业产生的大量皮渣如果仅作为动物饲料或肥料是不能完全消耗掉,这对生态环境造成巨大的影响[2]。金柑Fortunella crassifolia Swingle属芸香科金柑属植物,与柑橘属、枳属同为芸香科植物,是我国特有的柑橘类型。近年来,随着避雨栽培技术的推广,金柑产业发展迅速。尤溪金柑作为金柑中的一个优良品种获得良好的市场份额,但其在生产过程中疏除的落花落果常被作为废弃物丢弃,未能被充分利用,造成资源的浪费。金柑果肉和果皮中均含有多种黄酮类等生物活性成分,金柑中黄酮有良好的抗氧化、促进胃肠道功能、抗油脂化等作用[2-6]。近年来,已有研究人员对柑橘皮中的酚酸类物质进行了深入研究,但大多数是对柑橘不同器官和不同品种的酚类物质研究[7-10],尚未对不同发育期的金柑活性物质进行研究。本研究对金柑果实不同生长发育期酚酸和黄酮的含量进行分析,分析酚类物质果实成熟度之间的相互关系,同时对不同生长发育期金柑果实各个组织部位的主要黄酮类成分含量进行测定,旨在为金柑果实的深加工及综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试样品及制备
试验所用金柑果实采自福建省尤溪县的金弹Fortunella crassifolia Swing品种鲜果。在金柑第1次开花(6月15日)时,对其进行标记,分别在花后55、65、85、105、115、125、135 d采集,果实中等大小。采摘后立即于-40℃冷冻保存。
制备样品时将冷冻果实解冻,用清水洗净,手工剥皮将其分为果皮、果肉两部分,然后分别打浆均匀,然后取50~100 g 于冻干机冷冻干燥48 h,冻干品经粉碎过60 目筛,储存于-40℃备用。
1.2 试剂和仪器
11种化合物标准品,包括没食子酸Gallic acid绿原酸chlorogenic acid、咖啡酸caffeic acid、芦丁rutin、香豆酸p-Coumaric acid、阿魏酸ferulic acid、芥子酸sinapic acid均购自美国Sigma公司;乙腈、乙酸为色谱纯(Merck德国公司);超纯水为自制;其他试剂均为国产分析纯。
L2000型高效液相色谱仪(日本日立公司),配有紫外检测器、四元泵、柱温箱、自动进样器等;Sartorius BS224S分析天平(德国赛多利斯公司);TU1810紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);BPG9140A电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司); FW100高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);ALLEGRATM64R高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 样品溶液的制备 先将金柑样品果肉与果皮分离冷冻干燥过60目备用;0.1 g样品用1 mL 70%甲醇混合10 min室温,9000 r·min-1,15 min 4℃离心,重复3次,合并上清液于容量瓶中,用甲醇定容;用0.45 μm微孔滤膜过滤备用。
1.3.2 总黄酮含量的测定 称取10 mg芦丁,用70%甲醇溶解后定容至100 mL。之后将芦丁溶液用70%乙醇稀释成0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1,各吸取1 mL于试管中,加70%乙醇1 mL,加入0.3 mL 5%亚硝酸钠,6 min后加入0.3 mL 10%亚硝酸铝,6 min后再加入2 mL 2 mol·L-1氢氧化钠,10 min后于分光光度计波长510 nm下测吸光值OD。以吸光值为纵坐标,芦丁标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。
从提取液中吸取1 mL,加入1 mL 70%甲醇,加入0.3 mL 5%亚硝酸钠,静置6 min后,加入0.3 mL 10%亚硝酸铝,再静置6 min后,加入2mL 2 mol·L-1氢氧化钠,放置10 min后在510 nm下测吸光值。
1.3.3 总酚含量的测定 称取10 mg没食子酸,用70%乙醇溶解后定容至100 mL。之后将没食子酸溶液用70%乙醇稀释成0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1,在避光条件下,取200 μL過滤后的样品提取液,加入2.5 mL 10%(v/v)福林酚溶液,充分摇匀,在室温下培养2 min,加入质量浓度为75 g·L-1的Na2CO3溶液2 mL,充分混匀后用蒸馏水定容至10 mL刻度线并振荡混匀。50℃水浴20 min,快速冷却至室温,以相应试剂作空白,在最大吸光值765 nm 波长处测定吸光值。用没食子酸作标样制作标准曲线,结果以每克干样所含没食子酸总量(mg·g-1)表示。
精确移取提取液1 mL,按照绘制标准曲线的方法进行显色,于最大吸收波长765 nm处测吸光度,计算金柑幼果总酚含量。金柑幼果总酚质量浓度计算方法为:
A=0.6185C-0.1679
总酚得率(%)=(A+0.1697)×V/1.5 m
式中:A为试样测定时所得的吸光度;
C为没食子酸式样的测定浓度(μg·mL-1);
V为待测液体积(mL);
m为试样的质量(g)。
1.3.4 总酚酸含量的测定 优化后的色谱条件为色谱柱:MerckLiChrospher_100RP18e(250 mm×4.0 mm);流动相:2%乙酸水溶液和乙腈,流速:0.8 mL·min-1,进样量:10 μL,柱温:30℃,检测波长:280 nm,同时检测7种酚酸类化合物。流动相梯度洗脱程序见表1。
1.4 统计分析方法
试验数据采用SPSS 13.0 软件进行统计分析。其中,主成分分析调用Factor 过程,以总酚酸含量的测定欧氏距离测距,用最长距离法(Furthest neighbor)测量类间距,进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同生长发育期金柑果实中总黄酮含量变化
从图1可以看出,金柑果皮和果肉中总黄酮含量随着果实的成熟不断下降,分别从花后55 d到花后135 d含量平稳下降,其中果皮中总黄酮含量在花后115 d到花后125 d期间急速下降。果皮中总黄酮含量在花后45 d时最高,达到19.50 mg·g-1,果肉中总黄酮含量在花后55 d达到12.95 mg·g-1。金柑果实中总黄酮含量表现为果皮>果肉。
2.2 不同生长发育期金柑果实中总酚酸含量变化
不同生长发育期的金柑果皮中总酚酸含量变化趋势如图2。从图2可以看出,金柑果肉和果皮总酚酸含量均呈现下降-上升-下降的趋势,其中果皮总酚酸含量在花后125 d上升到最高后开始下降,果肉总酚酸含量在花后115 d上升到最高后开始下降。
2.3 不同生长发育期金柑果实中总酚含量变化
从图3可以看出,果皮和果肉中总酚含量随着果实的成熟,不断下降,分别从花后55 d到花后135 d含量平稳下降,其中果皮中总酚含量在花后115 d到花后125 d期间急速下降。果皮中总酚含量在花后55 d时最高达到19.57 mg·g-1,果肉中总酚的含量在花后55 d达到13.36 mg·g-1。金柑果实中总酚含量表现为果皮>果肉。
2.4 聚类分析
分别对金柑果皮和果实不同生长发育期14个样品的总酚、总黄酮和总酚酸含量进行Q型和R型聚类分析,以每个成分的含量作为变量,由SPSS 13.0软件利用欧氏距离作为样品的测定进行聚类分析,结果如图4、5。Q型聚类结果(图4)显示:不同生长发育期的金柑果皮被分为3类:第1类是花后55 d、花后65 d、花后85 d和花后105 d,其中55 d的代谢物含量与其他3个时间点差异较大;第二类是花后115 d、125 d和135 d的果肉。聚类分析结果(图5)表明,花后105 d到115 d是金柑果实总酚、总黄酮和总酚酸代谢变化的重要时期。果肉中黄酮和酚类物质在花后65~105 d变化不大,花后115~135 d变化对比花后105 d前的代谢物含量变化更大。R型聚类是对黄酮和酚酸含量指标进行聚类。从图4可知,金柑果皮和果肉中的聚类分析大体一致,果皮中各成分含量之间的差异较果肉的欧氏距离大。金柑果肉和果皮总黄酮和总酚的变化趋势一致,总酚酸果皮和果肉的总酚酸含量变化不大。
3 结论与讨论
黄酮和酚酸是植物自身的次生代谢物,尽管黄酮和酚酸的积累的主要因素是遗传,然而外界环境如不同季节、植物的营养、光照、微生物侵入等对黄酮的积累也产生一定影响[11]。有关黄酮在果实成熟过程中的积累规律已经在一些物种上做了研究。植株的树龄和成熟度是黄酮类物质变化的主要决定性因素,但是随着遗传和外界环境条件的影响,实际的含量是由黄酮生物合成和分解代谢反应的平衡来决定的。王丽娟等对不同生长发育期草莓果实研究表明,在绿熟期类黄酮含量较高,随着果实的成熟,含量逐渐下降,至紫红期又有所升高[12]。查尔酮合成酶(CHS)是将苯丙烷代谢途径引向黄酮类化合物的合成.该酶催化4香豆酸CoA 和丙二酰CoA 反应,合成查尔酮柚(苷)配基4,5,7三羟黄烷酮[13]。CHS 是苯丙烷系代谢途径中含量最丰富的酶之一,但该酶的催化效率较低,植物体内CHS的转录受到高浓度肉桂酸的抑制及高浓度的香豆酸促进[14]。
对柑橘幼果活性成分的研究表明在幼果期黄酮和酚酸含量很高。黄仁华等以纽荷尔脐橙果实为材料,果皮中黄酮的含量在后期下降与果皮中黄酮含量的变化主要与其合成代谢有关,在果实成熟期,其代谢速率可能高于合成速率[15]。刘英对四季柚的黄酮和酚酸进行研究表明:四季柚果皮中总酚酸含量数是随成熟度上升而先下降后上升,主要是肉桂酸型酚酸含量上升[16]。徐贵华等研究不同成熟期椪柑、温州蜜橘、胡柚果实中的主要酚类物质组成,结果表明柑橘果实中的酚类物质含量随成熟度的提高而减少,其提取液的抗氧化能力也随之减小。未成熟期的柑橘果实落果尤其适合于提取各种黄酮:椪柑果实可以用于提取橙皮苷、川陈皮素和橘皮素;温州蜜橘果实可以用于提取橙皮苷;胡柚果实可以用于提取柚皮苷和新橙皮苷[17]。
本研究对不同生长发育期金柑果皮黄酮和酚酸含量进行测定分析,在金柑样品中均检测出6种黄酮和5种酚酸类物质。在幼果期(花后45 d),总黄酮和总酚酸含量都很高,其中花后45~85 d,酚酸下降时间比黄酮提早10 d左右。这可能是由于酚酸是黄酮类物质合成的底物。另外金柑果实在花后55~85 d水分含量不断增加也是原因之一。花后85 d后,总黄酮和总酚酸含量变化趋于平稳。花后105~125 d,果皮中香豆酸含量急剧上升,其他肉桂酸含量下降,促进果皮中查尔酮合成酶的转录,将苯丙烷代谢途径引向黄酮类化合物的合成途径,是花后125 d金柑果皮黄酮类物质含量有所上升的原因之一。
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(责任编辑:林玲娜)