鼻咽癌患者血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的表达及其临床意义

覃炜玲 汤敏中 徐霄 陈学杰

【摘要】 目的 检测鼻咽癌患者血浆中BART-miRNAs的表达情况，评价它们对鼻咽癌诊治的临床应用价值。方法 采用反转录PCR检测111例首诊鼻咽癌患者、42例治疗后复发/转移鼻咽癌患者、22例非鼻咽癌患者及24名健康体检者血浆中BART-miRNAs，统计分析其与鼻咽癌患者临床特点的关系，以及治疗前后的变化，绘制ROC曲线，计算AUC，评估其作为鼻咽癌诊断工具的性能。结果 鼻咽癌患者血浆中EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p相对表达水平显著高于非鼻咽癌患者与健康体检者（P<0.05），均与患者N分期和临床分期相关（P<0.05），且在治疗后显著下降（P<0.05），而治療后转移患者相对表达水平显著升高。单独检测诊断鼻咽癌的AUC为0.829和0.833，联合检测诊断鼻咽癌的AUC为0.860。结论 检测血浆中EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p，可为鼻咽癌诊疗以及分期等进一步研究提供有效依据。

【关键词】 鼻咽癌;EBV;BART-miRNAs;EBV-miR-BART7-3p;EBV-miR-BART17-5p

中图分类号：R739.6 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.004

【Abstract】 Objective To detect the expression of BART-miRNAs in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma， and evaluate their clinical application values in the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma.Methods RT-PCR was used to detect BART-miRNAs in plasma of 111 patients with first diagnosed nasopharyngeal carcinoma， 42 patients with recurrent / metastatic nasopharyngeal carcinoma after treatment， 22 patients without nasopharyngeal carcinoma and 24 healthy controls. And then， relationship between BART-miRNAs and clinical characteristics of patients with nasopharyngeal carcinoma， as well as the changes before and after treatment， were statistically analyzed. ROC curve was drawn， AUC was calculated， and its performance as a diagnostic tool for nasopharyngeal carcinoma was evaluated.Results The relative expression levels of EBV-miR-BART7-3p and EBV-miR-BART17-5p in the plasma of nasopharyngeal carcinoma patients were significantly higher than those of patients without nasopharyngeal carcinoma and healthy people （P < 0.05）， which were all correlated with N stage and clinical stage of patients （P < 0.05）， and decreased significantly after treatment （P < 0.05）， and the relative expression level of metastatic patients increased significantly after treatment. The AUC of single detection for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma was 0.829 and 0.833， and that of combined diagnosis of was 0.860.Conclusion The detection of EBV-miR-BART7-3p and EBV-miR-BART17-5p in plasma can provide an effective basis for the diagnosis， treatment and staging of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】 nasopharyngeal carcinoma; EBV; BART-miRNAs; EBV-miR-BART7-3p; EBV-miR-BART17-5p

鼻咽癌系一种来源于鼻咽黏膜的上皮细胞恶性肿瘤，其发病与环境因素、EBV感染、遗传因素等密切相关，我国鼻咽癌发病和死亡仍处于世界较高水平，发病与死亡高发的区域主要集中在两广地区，发病率都在10/105以上[1～3]。鼻咽癌早期易漏诊，绝大部分新发鼻咽癌病例为局部晚期（Ⅲ期、Ⅳ期）[4]。随着放射治疗技术的发展，鼻咽癌的治疗已从传统的放化疗发展为以放疗为主的综合治疗阶段[5]。然而，由于仍然缺乏高效能低毒性的靶向药物与新的治疗方法，鼻咽癌患者不得不承受放射治疗与化疗药物带来的损伤与毒副作用，许多患者在治疗后出现了放射性鼻窦炎、放射性中耳炎、放射性颅神经损伤、放射性脑病等，还有不同程度的骨髓抑制、贫血、低蛋白血症等，这无疑加重了患者的疾病负担。寻找敏感特异的生物标志物可能是提高鼻咽癌治愈率、获得良好预后以及减少疾病负担的关键所在。EBV miRNAs在鼻咽癌中的表达谱已被广泛研究，BART-miRNAs高表达于鼻咽癌组织中[6～9]。在鼻咽癌细胞中，BART-miRNAs约占总miRNA含量的15.57%，然而在病毒和细胞基因的总体调控影响中，BART-miRNAs却占相当大的比例，有着很关键的作用[6，9]。因此， BART-miRNAs作为鼻咽癌诊断的血清学标志物的用途以及是否适合在临床推广应用则需要更大的样本量加以研究与验证。此次研究通过检测鼻咽癌患者治疗前后、非鼻咽癌患者以及健康体检者血浆中BART-miRNAs的表达情况，分析它们与患者临床特点、分期、复发及转移等的关系，以及治疗前、中、后的水平改变，评价它们在鼻咽癌诊治中的临床应用价值，并评估它们是否能用来准确预测预后及监测鼻咽癌复发或转移，以期为鼻咽癌的早诊早治与预后评估等提供有效、可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2019年8月～2020年3月间在梧州市红十字会医院就诊的鼻咽癌患者血液样本，以同阶段就诊的非鼻咽癌患者与健康体检者作为对照，记录他们诊断时的年龄、性别、诊断、临床分期、病史和转移状态等临床信息。所有鼻咽癌患者均经过鼻咽活检病理检查确诊，并根据WHO分类方法分类，既往无其他恶性肿瘤史;均行MRI检查、CT扫描等常规检查方法，评估患者肿瘤情况、淋巴结播散程度以及是否存在远处转移的情况，并根据鼻咽癌中国分期2017版进行准确分期。治疗方案由主诊医师依照个体化原则，科学合理制订。收集首诊鼻咽癌患者治疗结束时的血液样本，以分析治疗过程中BART-miRNAs表达水平的变化。所有样本均为患者诊疗过程中临床检测后剩余的血液样本，所有纳入分析的样本临床诊断信息完整可溯源，对于临床诊断信息保存不完整，样本量不足或源记录不清晰的样本则被剔除;人为因素（如操作不当、操作过程样本污染等）或仪器问题导致无法完成实验过程的样本则被剔除;实验重复孔结果之间差异大的样本剔除。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集与储存

所有血液样本均在采集后6小时之内处理，离心分离出血浆，分装到RNase-free冻存管中，置于零下80℃的低温冰箱保存，用于后续血浆RNA的提取和检测。

1.2.2 参照的选择与序列

选择合成的Caenorhabditis elegans microRNA，cel-miR-39-3p作为RNA提取、cDNA合成以及PCR期间变化的参照。从miRBas 中获取各目标序列，其中EBV-miR-BART7-3p为5-CAUCAUAGUCCAGUGUCCAGGG-3;EBV-miR-BART17-5p为5-UAAGAGGACGCAGGCAUACAAG-3;cel-miR-39-3p为5-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3。

1.2.3 BART-miRNAs的提取

采用天根生化科技生产的miRcute血清/外周血miRNA提取分离试剂盒从血浆中提取总RNA，即血浆200 μL与900 μL的裂解液MZA混匀，最终RNA在60 μL RNase-free Water中洗脱，保存于-80℃，直到进一步处理。提取过程中，所有样本加入等量的cel-miR-39-3p（InvitrogenTM mirVanaTM miRNA Mimics），以监测RNA提取的偏倚。

1.2.4 反转录与实时荧光定量PCR检测

取9.16 μL总RNA加入2.84 μL反轉录体系中，与3 μL的5×RT引物混匀，制备cDNA。反转录试剂盒TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit来自美国Applied Biosystems，反转录程序为：16℃ 30 min，42℃ 30 min反转录，85℃ 5 min终止反应，4℃保温。取2 μL的cDNA作为模板加入18 μL配制好的PCR体系进行扩增。其中，配制PCR体系的TaqMan Universal Master Mix Ⅱ（no UNG）以及PCR试剂盒TaqManTMSmall RNA Assay均来自美国Applied Biosystems。扩增条件为：95℃ 10 min，1个循环;95℃ 15 s，60℃ 60 s，50个循环。

1.2.5 结果计算与分析

查看扩增图谱，判断有无扩增，然后根据需要调整基线和阈值，查看每孔的Ct值。模板的丰度越低，Ct值越大，Ct值>40为低表达或不表达。取3孔Ct值的平均值作为终值，对于分析后的Ct值，运用2-ΔCt法来计算基因的相对表达量，ΔCt=Ct目的基因-Ct参照。模板丰度越低，Ct值越大，ΔCt也越大，相应的2-ΔCt值越小，为方便数据计算，所得数值均放大10 000倍。

1.3 统计学方法

运用IBM SPSS Statistics 26.0软件对各组数据进行正态性检验，结果各组数据均不符合正态分布，因而以中位数（四分位间距）[M（P25～P75）]描述各指标水平。采用K-W检验对各指标在鼻咽癌患者、非鼻咽癌患者与健康体检者中的表达差异进行分析;采用K-W检验对各指标与患者T分期、N分期及临床分期的关系进行统计分析;采用Mann-Whitney U 秩和检验对各指标与患者年龄、性别及M分期的关系进行统计分析;采用Friedman秩和检验对各指标在治疗前中后的差异进行分析;采用Spearman秩相关检验分析两变量的相关性，以α=0.05为检验水准，双侧检验。通过绘制ROC曲线，计算与比较ROC曲线下面积AUC，以评估各指标作为鼻咽癌诊断工具的性能。根据约登指数（Youden）最大原则选出最佳截断值，计算灵敏度与特异度。

2 结 果

2.1 研究对象临床资料特点

研究中对下列血浆样本进行了检测与分析：111例首诊治疗前鼻咽癌患者、42例治疗后复发和（或）转移鼻咽癌患者、22例非鼻咽癌患者以及24名健康体检者，各组间性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p在各组中的表达情况

剔除实验重复孔结果之间差异大的样本后，首诊鼻咽癌患者治疗前血浆中EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的表达水平明显高于非鼻咽癌患者和健康体检者，差异有统计学意义（P<0.001），表明EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p在鼻咽癌患者血浆样本中是特异并且可被检测的。见表2。

2.3 首诊鼻咽癌患者治疗前血浆EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p的表达与鼻咽癌患者临床特点的关系

血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的相对表达水平均因患者的淋巴结播散情况（N分期）与临床分期不同而存在统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 治疗对血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p表达的影响

首诊鼻咽癌患者中，41例患者具有综合放化疗结束时的血液样本，其中16例患者同时具有2个疗程化疗后及综合放化疗结束时采集的血液样本，研究中均对这些样本进行检测。为了分析治疗对血浆中EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p表达水平的影响，评价它们是否能用来准确评估疗效，研究中还检测了鼻咽癌患者2疗程化疗后与综合放化疗结束时，血浆中EBV-miR-BART7-3与EBV-miR-BART17-5p的表达情况。结果显示，随着治疗的进行，血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p表达水平显著下降，治疗后，两者的表达水平显著低于治疗前（P<0.001）。见表4。

2.5 综合治疗后复发或转移鼻咽癌患者血浆中EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的表达情况

综合治疗后发生复发和（或）转移的鼻咽癌患者，血浆EBV-miR-BART7-3p和EBV-miR-BART17-5p的相对表达量显著高于非鼻咽癌患者与健康体检者（P<0.05）;与首诊鼻咽癌患者比较，血浆EBV-miR-BART7-3p的表达水平较高，差异有统计学意义（P<0.05）;综合治疗后发生复发和（或）转移的鼻咽癌患者血浆EBV-miR-BART17-5p的相对表达量虽高于首诊鼻咽癌患者，但是差异无统计学意义（P>0.05）。见图1、2。

进一步比较综合治疗后复发或转移的鼻咽癌患者血浆中EBV-miR-BART7-3p和EBV-miR-BART17-5p表达水平，发现综合治疗后发生转移时，血浆EBV-miR-BART7-3p和EBV-miR-BART17-5p表达的水平显著高于首诊非转移（M0）或转移（M1）鼻咽癌患者，也高于治疗后发生复发的患者（P<0.05）。见图2、3。

2.6 EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p在鼻咽癌中的诊断价值

通过制作ROC曲线，评价EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p对鼻咽癌的诊断效能（图4）。EBV-miR-BART7-3p诊断鼻咽癌准确度中等，AUC为0.829，约登指数为0.540，P<0.001，95%CI为（0.755～0.903）;EBV-miR-BART17-5p诊断鼻咽癌准确度中等，AUC为0.833，约登指数为0.691，P<0.001，95%CI为（0.757～0.908）。见表5。

3 讨 论

EBV-BART-miRNAs在鼻咽癌中的作用机制已被广泛研究，EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p与鼻咽癌的发生、发展、侵袭、转移、复发等息息相关，强大、多效的生物学功能是其成为鼻咽癌诊断标志物并在临床推广应用的有力依据，市场前景广阔[4，10～17]。此次研究中，我们比较了首诊鼻咽癌患者治疗前与非鼻咽癌患者、健康体检者血浆中EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的相对表达水平，结果显示EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p在鼻咽癌患者血浆中相对高表达，在非鼻咽癌患者与健康体检者血浆中相对低表达甚至不表达，与先前报道相似[13～14，18～19]，进一步验证了检测血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p对于诊断鼻咽癌的临床意义。

临床分期以T、N、M分期为依据，目前，磁共振成像等影像学检查是鼻咽癌临床分期的首要或主要检查手段与诊断依据，但是影像学检查则更多以解剖学特征为依据，不容易发现早期病变的微小瘤灶，也不易于鉴别早期鼻咽癌与其他鼻咽增生性病变，在评估肿瘤状态与判断预后方面存在一定缺陷。而BART-miRNAs是由活的肿瘤细胞释放的，因此在鼻咽癌早期，监测BART-miRNAs的表达水平的变化可能比影像学检查更有利于发现早期活跃的肿瘤细胞，有助于早期鼻咽癌的发现与鉴别。N分期代表着淋巴结的播散程度与范围，是独立的预后因素之一，并能提示复发或远处转移的风险[20]。分析数据显示，血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的表達水平与患者的N分期呈正相关，随着分期的增加，表达水平显著上升，表明检测这两个BART-miRNAs能较好地反映转移瘤灶的负荷水平，对预测预后有较好的指导价值。此外，基于EBV-miR-BART7-3p、EBV-miR-BART17-5p的表达与N分期相关性，以及关于EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p生物学功能的研究，可以推断检测血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的表达水平，理论上能提示是否存在远处转移。但此次研究结果显示，血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的中位表达水平在非转移性鼻咽癌和转移性鼻咽癌患者之间无显著差异，即与M分期无关，这或许是因为M0期与M1期患者人数相差悬殊造成结果存在偏倚。EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p以及其他BART-miRNAs的表达水平是否能更好地反映鼻咽癌的分期，需要进一步扩大样本量作研究分析。

目前，临床上常通过触诊、影像学检查或纤维鼻咽镜来观察鼻咽肿物是否缩小或消退，并结合一些肿瘤标志物的表达水平的变化来判断治疗是否有效，而后续治疗方案的选择也以瘤灶的残存情况为依据。然而，对于微小的残存瘤灶，上述检查手段是很难检测到的。我们的数据显示，41例综合治疗后的患者在治疗结束时，查体或MRI提示颈部淋巴结缩小，或纤维鼻咽镜检查提示鼻咽肿物缩小甚至消退，或MRI提示鼻咽部瘤灶及颈部淋巴结较前缩小，临床上以此为判断治疗有效的依据之一。检测这41名患者血浆EBV-miR-BART7-3与EBV-miR-BART17-5p表达水平的变化，结果显示，随着治疗的进行，血浆EBV-miR-BART7-3与EBV-miR-BART17-5p表达水平显著下降，与其他学者的研究结果一致[14，18～19]。BART-miRNAs是来源于活的肿瘤细胞的，随着治疗的进行，肿瘤组织和细胞逐渐被清除、杀灭，活的肿瘤细胞减少，其分泌的BART-miRNAs随之减少，从而循环中BART-miRNAs的检出水平下降。尽管表达水平显著下降，但并非均下降到无法检出，或降低到与健康体检者一样的水平，19名影像学检查或纤维鼻咽镜检查显示肿物消退的患者，血浆中仍能检测到EBV-miR-BART7-3与EBV-miR-BART17-5p。EBV-miR-BART7与EBV-miR-BART7-3p能增强鼻咽癌细胞对常用于鼻咽癌治疗的化学药物顺铂的耐药性[11]，下调鼻咽癌细胞对放射治疗的敏感性[12];EBV-miR-BART17-5p也有助于降低鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性[15]。此外，放射会改变内皮细胞中miRNAs的水平，而受影响的miRNAs则调节内皮细胞在后续放射中对放射治疗的敏感性[21]。由此我们推断，上述因素可能最终导致鼻咽癌瘤灶不能被完全清除，而残存的瘤灶或癌细胞体积十分微小，影像检查手段难以发现，因而影响评估治疗后肿瘤残存情况与疗效的准确性，也不利于临床上对鼻咽癌患者放疗后制订有效的后续治疗方案。因此，监测血浆中残留存活的细胞分泌的BART-miRNAs的表达水平变化应比影像学检查更敏感，更能反映微小残留瘤灶的情况，尤其是残存的活细胞的情况，能为疗效的监测、改善治疗方案与预后提供更可靠的依据。

本研究中，血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的表达水平在非转移性鼻咽癌患者与转移性鼻咽癌患者之间无显著差异，但统计分析发现，综合治疗后发生转移的患者，血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p的表达水平明显高于首诊非转移鼻咽癌患者、首诊转移鼻咽癌患者以及治疗后复发的患者。BART-miRNAs由活跃的细胞释放到细胞外环境中，血浆EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p水平显著升高，提示残留的EBV与鼻咽癌细胞重新活跃，EBV编码的BART-miRNAs被大量释放到细胞外环境中。而大量表达的BART-miRNAs再次活化多条相关的信号通路，从而增强了鼻咽癌的侵袭性与远处转移的能力。因此，对于综合治疗后的鼻咽癌患者，监测外周血EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p等BART-miRNAs的水平，有利于早期发现潜在的转移。

研究表明，EBV-miR-BART7-3p 有助于增强鼻咽癌细胞的自我更新能力和再生的干细胞特性[22]，EBV-miR-BART17-5p能促进细胞增殖而发挥促进癌症发展的作用[16]，由此我们推断，若治疗不能完全清除EBV和癌细胞，残存的EBV和癌细胞在放射与化学药物的不断刺激下，不仅增强了对放射治疗与化疗药物的耐受性，而且EBV编码的BART-miRNAs也持续对相关靶点进行调控，鼻咽癌细胞自我更新和再生的干细胞特性可能也得到了进一步增强，经过长时间的自我修复、更新后，表现出了更强大的生物学活性，更活跃的鼻咽癌细胞释放更大量的BART-miRNAs 到细胞外，并随循环进一步播散到远处的组织、器官，导致远处转移的發生，因此循环中的BART-miRNAs含量显著升高。此次研究中，单独应用EBV-miR-BART7-3p或EBV-miR-BART17-5p对鼻咽癌的诊断价值中， AUC分别为0.829和0.833，与其他学者的研究结果相似[11，19]。结果提示，检测血浆中EBV-miR-BART7-3p与EBV-miR-BART17-5p，可为鼻咽癌早期诊断、鉴别诊断以及鼻咽癌分期系统的进一步研究，提供分子生物学的依据，并为患者预后判断、个体化治疗以及监测治疗后远处转移提供有效的指导。

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（收稿日期：2020-07-13 修回日期：2020-11-06）

（编辑：王琳葵 梁明佩）