RASSF1A基因在多种恶性肿瘤中的研究进展

张杨秋蓉 冯静云 张婕 杨静雅 罗金金 林堉娇 盛苗苗

昆明理工大学医学院650500

张杨秋蓉与冯静云对本文有同等贡献

0 引 言

肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。从全世界看，恶性肿瘤有日益增加的趋势。每年全球新发恶性肿瘤约1 409 万例，恶性肿瘤死亡病例约820 万例[1]。长期以来，人们错误地认为肿瘤是不治之症。如今人们意识到，早发现、早诊断、早治疗可明显改善肿瘤预后，甚至根治肿瘤。肿瘤的早发现有赖于定期健康查体、高危人群识别与风险评估（家族史、不良生活习惯、环境污染、职业危害等）以及有针对性的监测检查理念与技术方法的不断提升。不同的肿瘤诊断是临床查体、实验室化验、影像学观测与病理检查等多元诊断有效综合的选择[2]。近年来随着影像学的发展，CT、MRI、正电子发射计算机断层显像（PET-CT）等检查技术被越来越广泛地运用于临床肿瘤学的诊断。而肿瘤标志物的测定在肿瘤诊断过程中也越来越为临床医师所倚重。随着分子病理学和分子免疫学的快速进展，特异性强、灵敏度高的分子和免疫诊断及预后指标不断涌现。因此进一步从分子水平阐明恶性肿瘤的发生、发展机制，寻求有效的生物治疗靶标是改善恶性肿瘤预后的关键，也是提高国民健康、减少医疗支出的保障[3]。在各种内外致癌因素的长期作用下，细胞癌变始于单个细胞，其过程可以分为3 个阶段，即启动、促进和演进阶段。癌变分子机制主要包括癌基因激活、过度表达，抑癌基因突变、丢失，DNA 修复相关基因突变导致功能减弱或缺失，细胞凋亡机制障碍，微卫星不稳定，端粒酶过度表达和信号传导调控紊乱等。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活在肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。已在至少37 种肿瘤中发现了Ras 相关区域家族1A（Ras association domain family 1A，RASSF1A）基因甲基化，RASSF1A 基因可能是目前人类癌症中描述最频繁的甲基化基因[4]。本文介绍了RASSF1A 基因在不同恶性肿瘤中的异常甲基化，并综述了近年来其在一系列恶性肿瘤中的相关作用及机制的研究进展，以期为恶性肿瘤的早期诊断、个体分子靶向治疗及预后评估提供重要的指导依据。

1 RASSF1A 基因概述

Ras 相关区域家族（RASSF）由10 个成员组成（RASSF1～RASSF10），均包含一个特色的Ras 相关区域（RA 域）。RA 域分为两类，一类位于C-末端（RASSF1～RASSF6），另一类位于N-末端（RASSF7～RASSF10）。RASSF1A 是RASSF 的成员，位于3 号染色体的短臂（3p21.3）上[5]。RASSF1A～RASSF1G 是因两种启动子的差异使用和可变剪接而产生的不同转录本。研究结果发现，RASSF1A 含340 个氨基酸的开放阅读框，其氨基末端与富含半胱氨酸的甘油二酯或氟波酯结合区（C1 结构域）高度同源，故又称蛋白激酶C 保守区；羧基末端与Ras 效应蛋白Nore1 和Maxp1 高度同源[6]。RASSF1A 基因编码的蛋白类似于Ras 效应蛋白，可与DNA 修复蛋白XPA相互作用，还可抑制细胞周期蛋白D1 的积累，从而诱导细胞周期停滞。RASSF1A 基因缺失或表达异常与多种癌症的发病机理有关，表明该基因具有肿瘤抑制功能[7]。

作为推定的肿瘤抑制基因，RASSF1A 在调节细胞周期、细胞凋亡和微管动力学以及维持基因组不稳定性方面发挥作用，可通过多种途径抑制细胞生长，促进细胞凋亡和衰老[8]。因此，RASSF1A 基因在控制一系列关键细胞功能的信号通路中十分重要。根据表达遗传修饰机制，已知DNA 甲基化与人类癌症的发生发展有关[9]。启动子区域中胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤岛（CpG 岛）的异常甲基化可抑制相应基因的表达。RASSF1A 基因高甲基化可降低基因表达，并在功能上显示类似于纯合缺失或失活突变[10]。

2 RASSF1A 基因在呼吸系统高发肿瘤中的研究进展

2.1 鼻咽癌

鼻咽癌是一种罕见的恶性肿瘤，具有地理和种族分布特征。根据全球肿瘤流行病统计数据（GLOBOCAN）估计，2012 年全国约有86 700 例鼻咽癌新病例报告，导致死亡人数约50 800 人。东南亚每年鼻咽癌的发病率为0.015%～0.05%，而西方国家的发病率低于0.001%。远处转移是鼻咽癌患者死亡的主要原因。尽管CT 和MRI 是有效的，但均不能准确地为鼻咽癌患者提供预后或预测生物治疗靶标的有效性。因此，寻找早期检测鼻咽癌的新型非侵入性低成本生物标志物对于临床实践具有重要意义。

研究结果显示，鼻咽癌患者鼻咽癌组织、鼻咽刷牙样本和血液样本中的RASSF1A 启动子甲基化明显高于非肿瘤组织[11]。因此，RASSF1A 启动子甲基化可作为组织和刷洗样本的生物标志物，用于鼻咽癌的临床诊断。在未来，匹配良好的前瞻性研究对于确定鼻咽癌患者RASSF1A 启动子甲基化的预后和诊断至关重要。

2.2 肺癌

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在中国，肺癌是癌症死亡的主要原因。研究结果表明，早期诊断可显著提高肺癌患者的5 年生存率，但由于临床表现和病理特征的异质性，目前尚无有效且廉价的方法可用于肺癌的早期检测和筛查。对于疑似肺癌患者，早期通常进行纤维支气管镜检查，通过支气管肺泡灌洗可获得细胞学检查样本，进而在第一时间获得支气管肺泡灌洗液。

相关研究结果显示，早期肺癌患者的SHOX2和RASSF1A 甲基化水平均低于晚期肺癌患者[12]。最可能的解释是由于早期肿瘤的侵袭性较低，使得进入支气管系统的肿瘤细胞较少。作为评估肺病的重要方法，支气管肺泡灌洗液的细胞学检查已被广泛使用，但其灵敏度较低（43%～48%），同时存在大量模棱两可的病例。正如在上述研究中，对肺癌患者的支气管肺泡灌洗液样本进行细胞学检查，其灵敏度仅为5.7%，有81.3%的样本结果为阴性，同时有13.0%的样本结果是模凌两可的；而对肺泡灌洗液样本进行SHOX2 和RASSF1A 甲基化联合检测可将灵敏度从5.7%提高至71.5%，对于细胞学上的可疑和阴性样本，基因检测阳性率分别达93.8%和66.0%[12]。与细胞学检查相比，联合检测支气管肺泡灌洗液样本中SHOX2 和RASSF1A 甲基化可提高肺癌的检出率，并具有较高的灵敏度和特异性，有助于肺癌的早期诊断。

3 RASSF1A 基因在消化系统高发肿瘤中的研究进展

3.1 食管癌

食管癌在大多数情况下病程发展迅速且预后不良，已成为世界上最严重的肿瘤疾病之一。食管癌具有两种主要的组织学亚型：食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cancer, ESCC） 和食管腺癌。ESCC 是亚洲人群的主要亚型，而食管腺癌则在白种人群中更为常见。近年来，虽然早期诊断和多模式治疗已取得了一定的进展，但食管癌的预后仍然很差。食管癌患者的总体5 年生存率＜20%，大多数患者在确诊的第1 年内死亡[13]。

在ESCC 中已检测到多个遗传和遗传外改变，但ESCC 的致癌性及进展的精确分子机制仍然未知。杂合性缺失分析结果显示，3p21.3 是食管癌等癌症中常见的一个区域。已在多种癌症中观察到基因在该区表达下调，这意味着不同肿瘤的正负调节[14]。肿瘤抑制基因启动子区CpG 岛甲基化导致转录沉默是公认的共同机制。RASSF1A 基因失活的最常见机制是其启动子序列中CpG 岛的高甲基化。RASSF1A 基因高甲基化与基因表达的缺失高度相关，而5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理的去甲基化可使基因表达恢复，表明RASSF1A 基因高甲基化是其沉默的原因之一。RASSF1A 基因失活可刺激肺癌细胞的锚定依赖性生长，野生型RASSF1A 基因转染高甲基化的肺癌可抑制肿瘤生长，提示RASSF1A 可用作肿瘤抑制基因。据文献报道，RASSF1A 基因甲基化可能在ESCC 中起着重要作用。因此，研究RASSF1A 基因甲基化的功能后果及其在ESCC 中的致癌作用具有重要意义[15-16]。

3.2 胃癌

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，其症状与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似。目前，我国胃癌的早期诊断率仍较低。胃癌发生是一个多步骤过程，不仅包括基因突变，还包括表观遗传改变。其中最重要的是DNA 甲基化，其不仅影响肿瘤抑制基因，还可能参与细胞周期调控、DNA 修复、致癌物质代谢、细胞与细胞相互作用、细胞凋亡和血管生成。作为癌细胞的重要标志，启动子甲基化被认为是灭活癌症相关基因的主要机制之一，伴随着遗传改变，最终导致胃癌的发生[17]。

目前已发现越来越多的癌症相关基因，特别是肿瘤抑制基因在胃癌中被甲基化。随着对RASSF1A基因研究的不断深入，人们发现RASSF1A mRNA在胃癌组织中的表达水平明显低于正常胃黏膜组织，这表明RASSF1A 基因参与了胃癌的发生。RASSF1A 基因启动子高甲基化可能是导致其表达失活的重要原因，也是胃癌发生发展过程中的频发分子事件，并与胃癌的进展演变相关。胃癌组织中RASSF1A mRNA 的表达水平随分化程度的降低、临床分期的增加而明显降低，预示了胃癌的恶性程度高，临床分期晚。因此检测胃癌组织中RASSF1A 基因甲基化有助于评价胃癌的分级及判断肿瘤是否存在转移。此外，RASSF1A 基因失活广泛存在于各种上皮细胞肿瘤中，且失活与其启动子区高甲基化密切相关，故干预RASSF1A 基因的表达有可能在胃癌防治中起一定作用[18]。

3.3 胆管癌

胆管癌指源于肝外胆管包括肝门区至胆总管下端的一种高度恶性上皮肿瘤。胆管癌的遗传改变包括p53、APC、c-erbB-2、K-Ras 和频繁的p16INK4A改变。染色体3p21 的等位丢失在人类癌症中较为常见，虽然在染色体3p21 上存在多种肿瘤抑制基因，但RASSF1A 被认为是该区的主要肿瘤抑制基因[19]。

RASSF1A 含有RA 域，其中具有蛋白质功能效应的Ras 还参与了正常细胞中的信号传导。RASSF1A基因可能参与了胆管癌的发生发展及浸润转移过程，两者存在一定的相关性。相关研究结果表明，RASSF1A 基因在肝外胆管癌组织中的转录表达缺失率明显高于癌旁组织，且与肝外胆管癌的淋巴转移及TNM 分期相关。甲基化特异性PCR 和DNA 测序结果也证实启动子区CpG 岛高甲基化是RASSF1A基因表达缺失的主要机制之一。RASSF1A 的肿瘤抑制功能表现为其在细胞系中外源性重新表达后，集落形成减少，抑制不依赖贴壁的生长和肿瘤形成。此外，启动子高甲基化的胆管癌中提示RASSF1A 基因转录失活。因此，深入研究RASSF1A 基因可能对胆管癌预后具有重要意义。

3.4 肝癌

肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。有充分证据表明，乙型和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素B 暴露和大量饮酒是肝细胞癌的重要危险因素。也有文献描述了与肝细胞癌发展相关的许多遗传异常。除遗传改变外，基于DNA 甲基化的机制已被证明有助于肿瘤抑制基因的失活。异常甲基化基因可用作早期检测、肿瘤分类和治疗反应的生物标志物，例如靶向治疗、表观遗传因子和传统化疗药物。肿瘤患者外周血或组织中的甲基化信号是早期诊断、预测治疗反应和预后的潜在生物标志物[20]。

Abd-Elfatah 和Gad-Allah[21]的研究结果显示，RASSF1A 基因的启动子区在75.9%的非肿瘤肝组织和82.8%的肝细胞癌组织中发生了甲基化，截止值为4%甲基化速率，表明RASSF1A 基因启动子的甲基化频率高；当使用显著性更高的20%甲基化速率截止值时，仅有24.1%的非肿瘤肝组织和49.4%的肝细胞癌组织被认为存在RASSF1A 基因启动子的甲基化。该结果表明，肝细胞癌的癌旁组织中存在RASSF1A 基因启动子的中等甲基化。此外，与相应的非肿瘤肝组织相比，肝细胞癌组织中RASSF1A基因启动子的甲基化速率显著增加，表明这种表观遗传改变参与了肝癌的发生发展。

3.5 结直肠癌

结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。自2000 年以来，结直肠癌的发病率和死亡率均呈逐年上升趋势。结直肠癌早期症状不明显，多发于中年以上男性。

目前，已有许多关于结直肠癌相关基因甲基化状态的报道。甲基化特异性PCR 检测结果显示，抑癌基因RASSF1A 在结直肠癌细胞系、各种类型的实体瘤及结直肠癌患者血清中均存在较高的启动子甲基化。RASSF1A 可通过抑制JNK 途径诱导G1期细胞周期停滞。早期对于RASSF1A 的研究结果显示，微管稳定性通过激活的K-Ras 而增强，因此RASSF1A 可通过多重途径调节微管稳定，参与微管蛋白的动力学。总之，除了结直肠癌发生中众所周知的信号通路外，RASSF1A 甲基化可能是异常Ras信号传导的替代机制。随着对RASSF1A 基因研究的深入，将为结直肠癌的发生机制、分子水平监测及基因治疗提供新的参考依据[22]。

4 RASSF1A 基因在生殖泌尿系统高发肿瘤中的研究进展

4.1 子宫内膜癌

子宫内膜癌（endometrial cancer, EC）位列全球女性最常见癌症第7 位，其发病率呈上升趋势，故需更好地了解分子事件在癌症发生中的作用。作为妇科恶性肿瘤，EC 具有由异常遗传和表观遗传改变以及环境因素驱动的多因素特征。目前基因表达变异以及癌症相关基因的突变或缺失可能无法完全解释子宫内膜的癌变，其对染色质产生影响的同时却未改变DNA 突变基因表达的表观遗传引起了人们的注意。研究结果发现，启动子异常甲基化是子宫内膜肿瘤发生的早期和广泛的改变。RASSF1A 基因是肿瘤抑制基因之一，其启动子常在EC 中甲基化失活。RASSF1A 基因的这种表观遗传沉默表明其可能与EC 的发病机制有关。

人类RASSF1A 基因位于染色体3p21.3 上，含有8 个外显子，可产生7 个转录本。RASSF1A 基因启动子的异常甲基化已被确定为是RASSF1A 表达失活的主要原因，从而导致早期良性肿瘤向后期浸润性癌的恶性转化。RASSF1A 基因启动子甲基化可能是EC 的发病机制之一，RASSF1A 蛋白表达减少或缺失对EC 的发生、发展具有重要作用。研究结果显示，RASSF1A 是EC 的重要指标，具有高灵敏度（100%）和特异性（97.2%）。EC 中RASSF1A 基因启动子的甲基化率明显高于正常子宫内膜；EC 中RASSF1A 蛋白阳性表达率明显低于正常子宫内膜[23]。因此，RASSF1A 基因启动子甲基化可能与EC的发生和发展相关。RASSF1A 有望成为EC 的分子标志物，为EC 的早期诊断及生物靶向治疗提供理论依据。

4.2 卵巢癌

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。卵巢癌中以上皮癌最为多见，其次是恶性生殖细胞瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占妇科肿瘤首位，对女性生命造成了严重威胁，但对其分子发病机制仍知之甚少。有证据表明，遗传和表观遗传事件在卵巢癌中均发挥作用，表观遗传变化发生于致癌过程的早期，其包括DNA 甲基化和组蛋白修饰。许多基因通过DNA 甲基化在卵巢癌中沉默，如RASSF1A 基因。

Bondurant 等[24]研究发现，卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌患者血清以及健康志愿者血清中均未发生RASSF1A 基因甲基化；卵巢癌组织中RASSF1A 基因的甲基化状况与血清中出现RASSF1A 基因甲基化关系密切；卵巢癌患者中的RASSF1A 基因甲基化改变与肿瘤的临床分期、细胞分化程度、组织学类型无明显相关性，但与淋巴结转移密切相关[24]。因此，分析血清DNA 中RASSF1A 基因异常甲基化有可能成为辅助卵巢癌诊断的有效方法之一。

4.3 乳腺癌

自20 世纪70 年代末起, 我国乳腺癌的发病率一直呈上升趋势，已成为我国女性发病率最高的一类癌症。乳腺癌的发病机制非常复杂，对于RASSF1A 基因在乳腺癌中的研究，国外已有相关报道并正在进行深入探讨。研究结果显示，RASSF1A基因启动子甲基化为乳腺癌中的频发事件，其发生率随年龄增长而升高，在乳腺癌发生中起重要作用。

RASSF1A 基因表达缺失可能参与了乳腺癌的发生、发展过程，故RASSF1A 基因有可能成为乳腺癌患者预后的良好标志物之一。RASSF1A 基因几乎在全身正常组织器官中均有表达，但在多种实体肿瘤中表达缺失。其主要通过稳定微管、调控细胞周期以及增加细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的生长。RASSF1A 基因甲基化发生在乳腺癌早期，与肿瘤的TNM 分期、侵袭性及预后有关。RASSF1A 在乳腺癌组织中低表达，而在癌旁组织中高表达。文献报道RASSF1A 在癌旁组织中的表达阳性率明显高于乳腺癌组织（86.7%比35.0%，P＜0.05）；RASSF1A 的表达与淋巴结转移、组织学分级、脉管侵犯、人类表皮生长因子受体2 和Ki-67 表达有关，其高表达与临床分期、淋巴结转移、组织学分级和c-erbB-2 蛋白表达呈负相关[25]。RASSF1A 启动子甲基化可为部分乳腺癌患者提供重要的预后信息，并在乳腺肿瘤的临床行为中起重要作用。检测基因的甲基化状态有望成为一项具有可操作性的对乳腺癌预后生物标志物进行前瞻性评估的项目[26]。

4.4 前列腺癌

前列腺癌是发生于前列腺的上皮性恶性肿瘤。2012 年我国肿瘤登记地区前列腺癌的发病率为9.92/10 0000，位列男性恶性肿瘤发病率的第6 位。前列腺癌发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄为70～80 岁。前列腺癌的病因在很大程度上仍未定义。然而，越来越清楚的是，各种肿瘤抑制基因的表观遗传失活可能在前列腺癌等多种癌症发展中起关键作用。

肿瘤抑制因子RASSF1A 可能是目前人类癌症中描述最频繁的甲基化基因。RASSF1A 启动子的甲基化率与前列腺癌发生风险显著相关。RASSF1A 可抑制关键细胞周期调节剂细胞周期蛋白D1，最终抑制前列腺癌细胞的增殖及侵袭潜力[27]。另有研究结果显示，RASSF1A 启动子甲基化率与前列腺癌风险增加呈明显正相关。此外，前列腺癌患者前列腺组织中RASSF1A 基因的甲基化率与前列腺癌患者的Gleason 评分、血清前列腺特异性抗原和肿瘤分期呈显著正相关，表明RASSF1A 启动子甲基化率可用于前列腺癌的早期诊断及疾病预后预测。

5 RASSF1A 基因在神经系统肿瘤中的研究进展

5.1 神经母细胞瘤

神经母细胞瘤是儿童中最常见的实体瘤，占儿童癌症的8%～10%和儿童癌症死亡的15%。虽然婴儿局部成神经细胞瘤可自发消退或成熟，但儿童播散性肿瘤可抵抗多模式强化治疗。

RASSF1A 基因甲基化常见于临床诊断为神经母细胞瘤的婴儿或儿童，而CASP8 和DCR2 基因甲基化仅在儿童肿瘤中常见。当根据肿瘤的倍性状态分类时，发现RASSF1A 和PCDHB 基因甲基化仅与临床诊断为二倍体肿瘤患儿的MYCN 扩增和MYCN 异常有关；此外还发现RASSF1A 和PCDHB基因甲基化分别与三倍体和二倍体肿瘤患儿的预后有关，且与二倍体肿瘤患儿的MYCN 扩增有关[28]。因此基于患者年龄和肿瘤倍性状态，RASSF1A 甲基化可能具有两种生物学作用。

5.2 颅内原始神经外胚层肿瘤

颅内原始神经外胚层肿瘤（primitive neuroectodermal tumor,PNET）是儿童中最常见的恶性胚胎脑肿瘤，成神经管细胞瘤（medulloblastoma, MB）为其主要亚型。MB 与幕上原始神经外胚层肿瘤（supertentorial primitive neuroectodermal tumor, SPNET）虽在组织学上相似，但两者在其他方面仍有许多不同。临床上MB 占儿科脑肿瘤的25%左右，而SPNET 仅占10%左右，但MB 患者的5 年生存率（50%～70%）优于SPNET 患者（20%～30%）[29]。此外，MB 的遗传组成似乎也与SPNET 不同。异染色体17q 是MB 的特征，而染色体14q 和19q 的丢失在SPNET 中更常见。DNA 微阵列分析结果进一步揭示了MB 与SPNET 之间基因表达谱的差异，意味着两者是生物学上的不同实体。

MB 和SPNET 在组织学上类似于分布在大脑不同解剖部位的颅内PNET。有证据表明，启动子CpG 岛的高甲基化是多种人类癌症中常见的表观遗传事件。Chang 等[30]采用甲基化特异性PCR 检测了25 个原发性MB、9 个原发性SPNET、3 个MB 和2 个SPNET 细胞株中RASSF1A、FHIT 和sFRP1 启动子区的甲基化状态。结果显示，在2 个正常小脑和5 个正常脑组织样本中，均未检测到上述3 种基因的启动子高甲基化；相比之下，在100%的原发性MB、67%（6/9）的原发性SPNET 和所有SPNET 细胞株中均检测到RASSF1A 的启动子高甲基化，且SPNET 组的RASSF1A 启动子高甲基化率显著低于MB 组。此外，还在22%（2/9）和11%（1/9）的SPNET细胞株中分别检测到FHIT 和sFRP1 的启动子高甲基化，但在所研究的MB 中未检出FHIT 和sFRP1 的启动子高甲基化。由此可见，RASSF1A 的启动子高甲基化是颅内PNET 的常见事件，而FHIT 和sFRP1在一小部分SPNET 中受表观遗传学影响。

6 结 语

RASSF1A 基因为RASSF 家族成员，其以三磷酸鸟苷依赖性方式结合Ras 继而诱导由Ras 介导的凋亡。该基因的缺失或表达改变与多种癌症的发病机理有关，表明该基因具有肿瘤抑制功能。作为肿瘤抑制基因，RASSF1A 在调节细胞周期、细胞凋亡和微管动力学以及维持基因组不稳定性方面发挥作用，可通过多种途径抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老。由于肿瘤抑制基因的表观遗传失活在多种恶性肿瘤的发展中起关键作用，因此可通过对RASSF1A 基因的深入研究，为多种恶性肿瘤的治疗研究提供方向和新的分子靶点，同时利用其相关关系对肿瘤治疗的预后进行评定。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突