长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC联合检测对HBV相关肝癌的诊断价值

李双良 陶 艳

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第五大常见癌症和癌症死亡的第三大原因，占原发性肝癌的90%以上[1]。HCC的主要原因是持续的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染，其发生在一半以上的HCC中[2]。代表大多数人类基因组转录物的长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)最初被认为是“垃圾RNA”，因为它们不能编码蛋白质[3]。但是越来越多的证据表明，lncRNAs在各种生物过程中也发挥着重要作用，包括细胞增殖，侵袭和转移，自噬和细胞凋亡，从而促进不同人类癌症的发展，包括HCC[4]。最近，据报道，几种lncRNA在HBV相关的HCC组织和血清中经常失调，包括HOX转录物反义基因间RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR)、印迹母系表达的非翻译mRNA(imprinted maternally expressed untranslated mRNA,H19)、肝癌高度上调因子(highly upregulated in liver cancer,HULC)，然而，其在HCC诊断中的意义尚未明确[5-8]。基于此，本研究旨在探讨长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC联合检测对HBV相关肝癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2017年1月至2019年1月我院收治的早期HBV相关肝癌患者120例为肿瘤组，其中男性68例、女性52例，年龄37～71岁，平均年龄(47.28±15.92)岁；肿瘤直径1.2～2.5 cm，平均直径为(1.64±0.59)cm； TNM分期：Ⅰ期89例，Ⅱ期31例。120例早期HBV相关肝癌患者均经我院病理科证实。排除标准：①严重心、肝、肾功能损害者；②长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；③患有精神疾病者；④患有其他癌症者；⑤血清中HCV阳性者；⑥血清中HBV阴性者。同时，纳入2017年1月至2019年1月至我院体检的健康体检者120例为对照组，其中男性62例、女性58例，年龄41～72岁，平均年龄(48.20±17.29)岁。2组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，可纳入此次分析。受试者均签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR

采取120例HBV相关肝癌患者和120例健康体检者的清晨肘前静脉血6 ml。所有实验在取样后2 h内开始。长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC,GAPDH的引物均交由上海生工合成，序列见表1。使用内参GAPDH的表达量标准化HOTAIR,H19,HULC的表达量。RNA快速提取试剂盒购自南京赛泓瑞生物科技有限公司(货号：RN0302)。反转录试剂盒购自上海千曦生物科技有限公司(货号：k1622)。RT-PCR 两步法试剂盒购自百奥迈科生物技术有限公司(货号：BK2100)。根据试剂盒的说明书进行实时荧光定量PCR反应。

1.3 统计学分析

RISM 7.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用 LSD 法比较，方差不齐者采用Tamhane′T2法比较。应用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析长链非编码RNA HOTAIR、H19、HULC检测HBV相关肝癌的临床诊断价值。阳性临界值为ROC曲线中灵敏度-(1-特异度)的最大值所对应的数值。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV相关肝癌患者和健康体检者血清中长链非编码RNA HOTAIR、H19、HULC的表达量

HBV相关肝癌患者血清中长链非编码RNA HOTAIR、H19、HULC的表达量均高于健康体检者(P<0.05)，见表2。

表2 2组受试者血清中长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC的表达量比较

2.2 HBV相关肝癌患者和健康体检者长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC的ROC曲线、AUC、灵敏度、特异度和截断值

为了评估长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC在HBV相关肝癌患者与健康体检者中的诊断价值，绘制120例HBV相关肝癌患者和120例健康体检者的ROC曲线(图1)。HOTAIR的受试者工作特征曲线的AUC为(0.83±0.03)(95%CI 0.7734～0.8884)，以HOTAIR的阳性临界值为1.936，其诊断灵敏度为86%，特异度为85%；H19的受试者工作特征曲线的AUC为(0.87±0.03)(95%CI 0.8244～0.9248)，以H19的阳性临界值为0.8573，其诊断灵敏度为89%，特异度为90%；HULC的受试者工作特征曲线的AUC为(0.92±0.02)(95%CI 0.8878～0.9636)，以HULC的阳性临界值为1.593，其诊断灵敏度为91%，特异度为93%。见图1和表3。

2.3 长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC联合诊断HBV相关肝癌

患有HBV相关肝癌的为真阳性，未患有HBV相关肝癌的为真阴性。以HOTAIR的阳性临界值为1.936，H19的阳性临界值为0.8573，HULC的阳性临界值为1.593为诊断标准，三者均满足为联合诊断阳性，反之则为联合诊断阴性。长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC联合对HBV相关肝癌的诊断的的灵敏度为91.67%(110/120)，特异度为93.33%(112/120)，准确度为92.50%(222/240)，见表4。

表3 HBV相关肝癌患者和健康体检者长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC的AUC、灵敏度、特异度和截断值

表4 长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC联合诊断HBV相关肝癌/例

图1 HBV相关肝癌患者和健康体检者长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC的ROC曲线

3 讨论

HCC是全球第三大癌症相关死亡原因，是五种最常见的癌症之一[9]。在亚洲高度流行的亚太地区，特别是中国，HBV感染与70%～90%的HCC患者有关[10-12]。因此，尽早对HBV相关HCC进行诊断迫在眉睫。在本研究中，通过酶联免疫吸附试验检测研究组和对照组血清中长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC的表达量并评价其联合诊断HBV相关肝癌的价值，发现长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC联合鉴别早期HBV相关肝癌的诊断的灵敏度为91.67%，特异度为93.33%，准确度为92.50%。

HBV对HOTAIR的转录调控与2种转录抑制复合物的调节有关：PRC2和LSD1/Co-REST/HDAC1，它们通过与HOTAIR结合在一起[13-14]。本研究发现HBV相关肝癌患者血清中长链非编码RNA HOTAIR的表达量均高于健康体检者(P<0.05)。在HBV复制细胞中，发现Plk1被HBV的HBx蛋白激活，并且Plk1的激活诱导SUZ12(PRC2复合物的必需亚基)和ZNF198的蛋白酶体降解，促使LSD1/Co-REST/HDAC1复合物不稳定，导致染色质修饰并导致HOTAIR转录的激活。长链非编码RNA HOTAIR在鉴别早期HBV相关肝癌患者与健康人群的灵敏度和特异度分别为86%和85%，提示长链非编码RNA HOTAIR是一种潜在的HBV相关肝癌的肿瘤标志物。

HBV对另一种lncRNA HULC的转录调控是由CREB介导的[15]。本研究发现HBV相关肝癌患者血清中长链非编码RNA H19的表达量均高于健康体检者(P<0.05)。据报道CREB将P300和Brg募集到HULC启动子中，导致表观遗传标记和染色质重塑的激活并导致HULC的转录。通过与CREB相互作用，HBx激活HULC启动子活性，从而增加HULC转录。长链非编码RNA HULC在鉴别早期HBV相关肝癌患者与健康人群的灵敏度和特异度分别为89%和90%。因此，长链非编码RNA HULC可作为临床上诊断HBV相关肝癌的潜在标志。

已经发现HBV相关HCC中的H19通过调节EMT相关基因，多种的信号传导途径和肿瘤微环境来调节HCC细胞的侵袭和转移[16-20]。本研究发现HBV相关肝癌患者血清中长链非编码RNA HULC的表达量均高于健康体检者(P<0.05)。H19通过促进表观遗传调节增加miR-200家族的表达来抑制EMT相关转录因子ZEB1/2的表达，而HBx-LINE1消耗miR-122，促进EMT样变化，包括Wnt/β-catenin信号激活，E-钙粘蛋白受到抑制，细胞迁移增强，从而促进HCC细胞的侵袭和转移。长链非编码RNA H19在鉴别早期HBV相关肝癌患者与健康人群的灵敏度和特异度分别为91%和93%，显示了较好的诊断效能。

综上所述，长链非编码RNA HOTAIR,H19,HULC的表达量可作为诊断早期HBV相关肝癌的潜在标志。