微小RNA 155对骨免疫的调控及其在牙周炎中作用的研究进展

孙坚炜 雷利红 谭静怡 陈莉丽

浙江大学医学院附属第二医院牙周科 杭州 310009

牙周炎是一种以菌斑生物膜为主要致病因素 的慢性感染性疾病，主要临床表现为牙龈炎症和出血、牙槽骨吸收、附着丧失及牙周袋形成，最终可导致牙齿脱落，严重影响患者生活质量[1]。因此，在牙周炎治疗过程中如何阻止牙槽骨吸收，预防患牙松动、脱落一直是临床工作者关注和研究的重点。

骨免疫学主要探究免疫系统与骨骼系统之间的相互作用，在牙周炎进展过程中过强的自身免疫反应常导致骨质破坏。近期，研究者[2-4]发现微小RNA（MicroRNA，miR）155在牙周炎患者的龈沟液和类风湿性关节炎患者的外周血单核细胞中的表达量可上调，miR-155可直接作用于骨骼系统细胞或通过免疫系统等间接参与骨性疾病及骨改建中。本文就miR-155在骨免疫中的相关研究进展进行综述，旨在阐述miR-155在骨免疫中的调控机制及其在牙周炎发生过程中可能的作用。

1 miR-155及其相关疾病

miR-155位于人类21号染色体的B细胞整合簇上，其基因具有高度保守性[5-6]。作为典型的多功能miRNA的一员，miR-155可诱导蛋白质Argonaute靶向作用于信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'-非编码区以沉默靶基因[7]，在肿瘤发生、造血谱系分化、免疫及炎症反应等多种生理或病理过程中发挥关键作用。有报道[8-11]显示，miR-155能靶向作用于肿瘤蛋白53诱导核蛋白1（tumor protein 53 induced nuclear protein 1，TP53INP1），由此增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力，促进胰腺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤发展。在B细胞中选择性过表达miR-155，能诱导B细胞多克隆增殖，促进B细胞恶性肿瘤的发生[12]。此外，来自巨噬细胞外泌体的miR-155可进入心脏成纤维细胞中，通过靶向作用Son of Sevenless（SOS）1和细胞因子信号抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）1，抑制心脏成纤维细胞增殖，促进炎症反应，这一过程与心脏损伤密切相关[13]。

近年来，miR-155在免疫炎症反应中的作用越来越引人注目。2008年，Stanczyk等[14]首次发现类风湿性关节炎患者的滑膜组织中miR-155表达量可高达健康者8倍。随后，在类风湿性关节炎患者的全血及外周血单核细胞中观察到miR-155高水平表达[15]，且其表达量还能随着关节炎严重程度加重而递增[2]。上述证据提示miR-155或许可作为骨关节炎的诊断标志物。而体外实验[14]显示，在过表达miR-155的类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞中，在炎症反应中引起组织损伤的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3的表达量减少。提示miR-155在特定的细胞和炎症环境中也可能作为一种保护性miRNA发挥作用。2011年，Xie等[16]的研究显示，在牙周炎患者的牙龈组织中miR-155水平降低；进一步靶基因预测发现，miR-155可能通过SOCS1、成纤维细胞生长因子7、Toll样受体信号通路等对牙周炎症进行调控。miR-155对多种疾病的调控机制正逐步被阐明，且根据其在牙周炎和类风湿性关节炎中的作用，可推测miR-155在骨稳态的维持中也有所涉及。

2 骨免疫学

骨组织的形成和形态、功能的维持是骨基质不断分泌和吸收这一动态过程的结果。当成骨细胞（osteoblast）和破骨细胞（osteoclast）的数量和功能的平衡丧失时，骨代谢的稳态将被打破，会导致牙周炎、骨质疏松症、类风湿性关节炎等骨破坏性疾病的发生[17-19]。本世纪初，Arron等[20]首次提出骨免疫学这一概念，认为骨骼系统与免疫系统之间可以相互调控，由核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）所组成的系统则是二者沟通的主要桥梁。常见的与骨代谢相关的免疫细胞包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞等。

2.1 免疫细胞对骨代谢的调控

T细胞介导的免疫应答反应是免疫系统参与骨代谢调控过程的重要方式[21-24]。激活的CD4+T细胞和CD8+T细胞能分泌RANKL、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-16和IL-17，促进破骨细胞形成[21]。辅助性T细胞（T helper cell，Th）17可分泌IL-17，被认为是促破骨能力最强的T细胞亚型[22]。已知IL-17能减少成骨前体细胞的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和其分泌的骨基质矿化程度；同时降低骨钙素（osteocalcin，OCN）和成骨相关转录因子抗体的表达水平[23]。体内实验[24]还发现，IL-17能够有效抑制大鼠颅骨缺损模型的修复。然而，Wang等[25]报道IL-17可以促进小鼠颅骨原代成骨细胞在早期分化过程中成骨分化相关分子ALP、Runt相关转录因子（Runtrelated transcription factor，Runx）2、OCN和OPG的表达。另有研究[26-28]显示，调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）既能通过表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen，CTLA）4激活吲哚胺2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase），促进破骨前体细胞凋亡，也可通过分泌IL-4、IL-10和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β抑制骨吸收作用。此外，Takayanagi等[29]发现Th1和Th2产生的干扰素（interferon，IFN）-γ能够通过诱导RANK和肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）6快速降解，干扰RANKL-RANK信号通路，进而抑制破骨前体细胞向破骨细胞转化。

尽管活化T细胞和破骨细胞的相互作用被认为是骨免疫学的核心[30]，B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞对于骨代谢的调控也不可忽视[31]。

在生理条件下，B细胞是OPG的主要来源[32]。将小鼠体内的B细胞敲除后，可引起OPG减少和破骨细胞骨吸收速率增加[33]。与此同时，B细胞也能产生另一骨代谢关键分子RANKL。Onal等[34]发现特异性敲除B细胞RANKL相关基因，能够缓解卵巢摘除术小鼠的骨质丧失。

有研究[35]发现，当用巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和RANKL处理未成熟的树突状细胞后，树突状细胞能分化为功能性破骨细胞。

在炎症过程中，巨噬细胞是炎症因子的主要生产者，其产生的炎症因子主要取决于其活化及极化状态。大量研究[36-40]表明，M1型巨噬细胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-16等促炎因子，具有显著的促骨质吸收作用；M2型巨噬细胞则能通过分泌IL-10、TGF-β等相关抗炎因子，有利于骨的再生和修复。

有研究[41-42]结果显示，中性粒细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞也具有促破骨细胞的作用。

2.2 骨骼系统对免疫细胞的调控

另一方面，骨骼系统对免疫细胞的发生、成熟也有调控作用。

多项研究[43-45]显示，成骨细胞可产生趋化因子亚族CXC配体（CXC ligand，CXCL）12、Delta样配体（Delta-like ligand，DLL）4、IL-17，分别调控B祖细胞、T祖细胞和淋巴祖细胞。此外，成骨细胞也可通过缺氧诱导因子依赖方式产生促红细胞生成素，促进红细胞的生成[46]。当成骨细胞受损后，小鼠骨髓内的淋巴细胞数量减少，其造血功能可被破坏[47-48]。

破骨细胞在骨吸收过程中可引起局部骨基质中的钙离子和TGF-β的释放，调控造血干细胞的定位、静止及自我更新[49-50]。Lymperi等[51]报道，通过双磷酸盐处理抑制破骨细胞功能后，可引起造血干细胞数量的减少并降低其移植潜力。

骨硬化素主要由骨细胞表达。Cain等[52]在敲除骨硬化素基因的小鼠中发现，骨髓中成熟的B细胞数目显著减少。不仅如此，终末分化的骨细胞还可通过粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor）的表达，增加中性粒细胞和血小板的数量，提示骨细胞可以调节髓系细胞的分化[53]。

综上，免疫系统和骨骼系统在生理和病理条件下均存在密切联系。众所周知，牙周炎是一种以细菌为主要致病因素的慢性感染性疾病，机体的免疫炎症反应是牙周炎导致牙槽骨吸收和牙齿脱落的重要因素[54]。在研究牙周炎过程中骨骼系统变化的同时，需要一并关注免疫系统的异常表现，将二者视为一个整体。

3 miR-155对骨免疫的调控

3.1 miR-155对骨免疫相关免疫细胞的调控

miR-155可靶向抑制特定基因，影响信号通路和细胞表型[55]。活化的B细胞、T细胞、巨噬细胞和树突状细胞中均具有相当高的miR-155表达量。有学者[56-57]通过使胚胎干细胞产生突变等位基因获得miR-155缺陷小鼠，发现miR-155缺陷小鼠的生发中心功能被抑制，其T细胞依赖性抗体和TNF-α、淋巴毒素α、IFN-γ等细胞因子的产量减少。

miR-155通过多条信号通路调控T细胞向特定的亚型分化，改变T细胞亚型之间的平衡关系，间接参与骨代谢过程。Zhang等[58]通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR，qRTPCR）分析T细胞特异性转录因子Tbx21、Gata3、Rorc和Foxp3的表达量，发现高表达miR-155的骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell）和脾脏单核细胞（spleen mononuclear cell）共培养后能够抑制脾脏单核细胞中Tbx21和Rorc表达，而增加Gata3和Foxp3的表达量，表明miR-155能够促进T细胞向Th2和Treg表型分化，而抑制其向Th1和Th17分化，使间充质干细胞产生免疫抑制作用。而Rodriguez等[56]报道在敲除miR-155的基因后，CD4+T细胞则更容易向Th2分化。进一步研究[59-61]发现，当miR-155缺失后，miR-155靶蛋白c-Maf水平上升，而c-Maf可促进Th2分泌IL-4、IL-5、IL-10，起到阻滞RANKL信号通路以抑制破骨的作用。此外，miR-155还能通过靶向抑制CD4+T细胞中SOCS1的表达，抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB、IL-2/STAT5和IL-6/STAT3等信号通路，由此促进T细胞的增殖、活化或向Th17和Treg分化，增加IL-17的表达量[62]。由此推论，miR-155参与T细胞的分化过程，但它是否通过T细胞对骨代谢进行调控仍需深入研究。

另有研究[57]表明，miR-155缺陷小鼠的树突状细胞抗原呈递功能缺失，无法有效激活T细胞。Dunand-Sauthier等[63]发现，在活化的树突状细胞中，miR-155可靶向抑制精氨酸酶2的表达，阻止细胞外微环境中精氨酸的过度消耗，而成熟的树突状细胞只有在富含精氨酸时才能启动T细胞的应答，促进T细胞的增殖。此外，miR-155可靶向作用于IL-13受体α1，抑制STAT6活化，促进巨噬细胞的活化[64]。Zhang等[65]进一步发现，miR-155可靶向作用于SOCS1，导致STAT1的激活及STAT6信号通路的抑制，并调节骨髓来源巨噬细胞向M1型转化。有研究[56]显示miR-155具有调节巨噬细胞向M1型转化的作用，这将促进炎症反应和组织损伤。以上研究表明，miR-155可以作用于不同靶蛋白，促进免疫炎症反应，由此间接增强免疫炎症导致的骨质吸收。

综上所述，miR-155可通过靶向作用于不同免疫细胞靶蛋白的mRNA调节免疫炎症反应，而miR-155对T细胞亚型分化方向的调控作用目前仍存在争议。目前，关于miR-155通过免疫系统影响骨代谢的机制尚未明确，还需从细胞层面对成骨细胞和破骨细胞的平衡进行更深入的研究。

3.2 miR-155对成骨作用的调控

骨髓间充质干细胞是一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞[66]，受TGF-β、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等多种因子调控，可以向成骨细胞、成软骨细胞或成脂肪细胞分化。多项研究表明，miR-155可能参与骨髓间充质干细胞分化过程的调节。Hou等[67]通过微阵列分析发现，在(+)-胆甾酮-3-1[(+)- cholesten-3-one，CN]诱导的间充质干细胞成骨分化过程中，miR-155的表达水平降低。另有学者[68]以BMP-2诱导过表达miR-155的MC3T3-E1细胞成骨，发现细胞中的ALP活性和表达量、茜素红染色强度等成骨指标均降低；进一步荧光素酶报告基因测试发现，miR-155能够与Smad5 mRNA上的3'-非编码区结合；实验表明miR-155通过靶向作用于Smad5，抑制成骨前体细胞向成骨细胞分化。与此同时，miR-155还能靶向作用于Runx2和BMP受体9，抑制由BMP-9诱导的成骨分化作用[69]。而Zhao等（2018全国口腔生物医学学术年会）则发现，miR-155可通过负性调控缺氧诱导因子（hyp-oxiainducible factor）-1α的表达，抑制原代成骨细胞的成骨向分化。上述研究提示，miR-155可能是成骨向分化的负调控因子，通过靶向作用于多种不同蛋白质的mRNA，发挥抑制成骨作用。

3.3 miR-155对破骨作用的调控

破骨细胞起源于骨髓造血系细胞的单核巨噬细胞系统，其高度分化具有显著的骨吸收作用[70]。感染牙周组织的牙周致病菌及其毒性产物和免疫炎症因子等可增强破骨细胞活性，导致牙槽骨吸收[71]，而破骨细胞的活性决定了牙槽骨吸收的程度[70]。因此，探究如何抑制破骨细胞活性以减缓牙槽骨吸收的机制仍是目前的研究热点。

miR-155对破骨细胞的分化、功能具有双向调节作用。Sul等[72]从小鼠股骨和胫骨中获取骨髓来源巨噬细胞（bone marrow macrophage），以M-CSF和RANKL诱导培养40 h，获得破骨前体细胞，再以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理破骨前体细胞24 h后，通过qRT-PCR发现miR-155的表达量增加。随后将miR-155类似物转染到破骨前体细胞中，酸性磷酸酶同功酶TRAP、降钙素受体、组织蛋白酶K、树突状细胞特异性跨膜蛋白（dendritic cell specific transmembrane protein，DC-STAMP）和溶酶体基因ATP6v0d2等破骨细胞特殊基因的表达水平均上调，且TRAP阳性多核细胞数量增加。实验[72]证明，LPS诱导破骨前体细胞产生miR-155，并且miR-155表达水平的升高可促进破骨细胞的形成，增加破骨细胞的活性，提示miR-155或许可成为治疗炎症反应引起的骨质破坏的一个靶点。

与之相反， Zhao等[73]报告miR-155对破骨细胞分化可能有抑制作用，采用逆转录病毒上调鼠骨髓来源巨噬细胞中的miR-155后，破骨分化标志物DC-STAMP、组织蛋白酶K和活化T细胞核因子c1（nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1）等表达水平降低，TRAP阳性细胞数量减少；同时，破骨细胞生成的2种必要调节因子SOCS1和小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）的水平下降，结果表明miR-155可靶向作用于SOCS1和MITF，抑制破骨细胞分化。Zhang等[74]的实验也证实miR-155能够靶向作用于SOCS1和MITF，调控IFN-β对破骨细胞分化的抑制作用，阻止破骨细胞形成。另有学者[75]采用CRISPR/CAS9基因编辑技术定向敲除鼠巨噬细胞系RAW264.7的miR-155基因，降低内源性miR-155，发现在LPS+IFN-γ共同刺激下，巨噬细胞产生的炎性因子IL-6、IL-12和TNF-α减少；而miR-155基因敲除的RAW264.7细胞在RANKL诱导破骨分化后，能观察到更多TRAP阳性细胞，表明miR-155具有促进炎症反应和抑制破骨细胞生成的作用。

上述研究表明，miR-155对破骨细胞的分化、功能具有双向调节作用，miR-155对破骨细胞的调控效应尚不明确，其具体功能机制仍有待深入研究。

4 miR-155在牙周炎中的作用

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是引起牙周炎的“核心”病原菌（keystone pathogen），主要功能包括对牙周局部宿主免疫功能的抑制和牙周局部菌群整体致病性的提升[76]。Xie等[77]发现，以牙龈卟啉单胞菌LPS刺激人牙龈成纤维细胞8 h后，细胞中miR-155的表达水平可显著升高。与此同时，Nayar等[78]以牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体等多种牙周致病菌感染大鼠牙龈组织，12周后发现大鼠牙龈组织中的miR-155水平有所增加，提示在牙周炎的发生、发展过程中可能有miR-155的参与。

已有多项研究[4,79]表明，在慢性牙周炎患者的牙周组织中，miR-155的表达水平会发生改变，但miR-155与牙周炎发生、发展的确切关系尚不明确。Xie等[16]分别从10名牙周炎患者和10名牙周健康者获取牙龈组织，对提取的RNA进行微阵列分析，发现牙周炎患者的牙龈组织中miR-155的表达量较健康对照组明显减少。然而，有研究[79]结果与之恰好相反，发现牙周炎患者牙龈组织中的miR-155表达量比健康牙龈组织增加了1.7倍。与此同时，有学者[4]在牙周炎患者的龈沟液中观察到miR-155高表达，当对患者进行非手术性牙周治疗干预后，miR-155的表达量可以恢复至牙周健康者同一水平；进一步多变量分析显示，miR-155的表达量与牙周炎具有显著相关性。由此认为miR-155可能是一种新型的牙周炎阳性诊断生物标志物。

miR-155可通过多种途径对牙周炎的发生及发展过程进行调控。Xie等[16]通过采用targetscan和MicroRNA.org两种目标基因预测算法发现，miR-155可能靶向作用于SOCS1、成纤维细胞生长因子7、IκB激酶ε（IκB kinase ε，IKKε）等相关信号通路，影响免疫炎症反应和成纤维细胞的增殖、分化。有学者[80]以牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌刺激miR-155缺失的端粒酶永生化人牙龈角化细胞发现，IL-8和CXCL1的mRNA和蛋白质水平均可提高；进一步实验发现，在miR-155敲除牙龈细胞中，NF-κB的mRNA表达量稍有增加，而IKKε的mRNA表达量可升高2倍左右。IKKε水平的增加可使细胞产生更多的NF-κB，有利于细胞产生更多的炎症因子。结果表明在微生物感染后，miR-155能减少人牙龈组织中相关炎症因子的表达。Zheng等[81]发现，与牙周健康者的牙周韧带干细胞相比，来自牙周炎患者的牙周韧带干细胞外泌体中具有更低的miR-155表达量。miR-155可靶向降低组蛋白去乙酰化酶的表达水平，继而减弱维甲酸相关孤核受体（retinoid-related orphan nuclear receptor，ROR）γt的转录活性，抑制Th17的传代和功能[82]。上述实验提示，miR-155可能是一个负调节因子，通过一系列信号通路，缓解牙周炎过程中的炎症反应。

然而，另有研究[83]发现，miR-155可靶向作用于SOCS1，抑制其对牙周炎的负反馈调节作用。因此，在牙周炎进展过程中，miR-155对炎性因子可能有负向亦或是正向调节作用，其中的机制还需进一步探索。

5 展望

miR-155对机体细胞代谢的调控作用正逐步被阐明，不仅参与机体的免疫、造血、炎症等生理与病理过程，更对骨免疫调节发挥着重要作用。现有实验显示，miR-155能与靶基因结合直接作用于间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞，也可以通过免疫系统间接进行骨代谢的调控。但是，miR-155的靶基因多样，且牙周炎是一种由多种免疫炎症因子参与的疾病，miR-155在该过程中可以形成一个极其复杂的调控网络，其具体机制仍有待进一步探索。对miR-155与骨免疫的关系进行研究，有助于进一步解释牙周炎等骨吸收类疾病的发病机制。未来，通过miR-155靶向治疗牙周炎症所致的骨质吸收或将成为可能。