生殖遗传技术预防线粒体遗传病的研究进展

纪冬梅，曹云霞

1978年世界首例体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）产生的“试管婴儿”诞生以后，辅助生殖技术及其衍生的配子/胚胎显微操作技术迅速发展成熟，与分子遗传学的发展相结合促生的生殖遗传技术包括胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）为许多遗传性疾病的预防提供新思路、新方法。线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）异常可导致严重的线粒体遗传病，至今无法治愈。虽然PGT技术在世界范围内已经广泛开展用于预防染色体遗传病或核基因组异常导致的遗传病，但是线粒体遗传病是否也可以借助PGT技术进行预防？生殖遗传新技术即线粒体置换技术用于预防线粒体遗传病是否更有价值呢？现对PGT、产前诊断及新型线粒体置换技术在预防、阻断线粒体遗传病中的研究进展进行综述。

1 mtDNA与线粒体遗传

线粒体是存在于真核细胞中的重要细胞器，其主要作用是通过氧化磷酸化产生能量，被称为细胞的“能量工厂”。线粒体含有自身的遗传物质和遗传体系，是动物细胞内唯一存在于细胞核外且含有遗传物质（即mtDNA）的细胞器。人类mtDNA是1个双链环状DNA，大小约16 569 bp，共编码13条多肽链、22种tRNA和2种rRNA，13种蛋白质均是呼吸链酶复合物与氧化磷酸化系统（oxidative phosphorylation system，OXPHOS）的亚单位，与核DNA（nDNA）编码的1 145种蛋白质共同维持氧化磷酸化的正常功能[1]，因此线粒体功能受到线粒体基因和核基因双重控制。理解mtDNA的遗传学特征对于了解mtDNA疾病至关重要，包括mtDNA基因组的多拷贝性质、不同细胞类型含mtDNA分子数量不同。以人类配子为例，人类精子mtDNA拷贝数约100个，而成熟卵母细胞mtDNA拷贝数约10万～60万个。mtDNA的特点之一是异质性，即2种及2种以上类型mtDNA可共存于某一组织或细胞内，而当某一组织或细胞内只存在同一类型mtDNA基因组时，称为同质性。研究发现尿液中的突变mtDNA含量比血液和口腔黏膜中的突变mtDNA比例高，即异质性更高，因此尿液更适于致病mtDNA的筛查[2]。重要的是，在含有致病性mtDNA突变的异质性个体中，突变型与野生型mtDNA的比例决定了疾病的临床表现，通常突变mtDNA负荷越高症状越严重。当mtDNA突变的水平达到或超过某个阈值时才表现临床症状，这就是所谓的阈值效应。阈值通常被认为是60%～80%的突变负荷，也可以根据具体的mtDNA突变不同而变化[3]，但某些疾病的发病阈值仍然未知。

mtDNA的另一个显著特点是母系遗传，即只有母亲能将mtDNA传递给子代，也只有女儿能将致病的mtDNA继续传递给下一代。在健康人群中没有父系mtDNA基因型出现[4]，最有可能的原因是在受精后的卵母细胞内有针对性破坏父系mtDNA的物质[5]。在细胞有丝分裂和减数分裂过程中，经过复制新合成的mtDNA以随机的方式分配到子细胞中，可导致子细胞中mtDNA异质性发生改变，称为复制分离（replicative segregation）。例如，在卵子发生过程中，mtDNA数目是不断变化的，在胚胎发生和组织形成的细胞分裂过程中，线粒体的选择、分配是随机的。人成熟卵母细胞约含10万个mtDNA，只有约100个mtDNA被随机选择遗传给下一代，再经过复制扩增构成子代卵子的线粒体群。这种卵母细胞形成过程中mtDNA数量剧减过程称为线粒体遗传瓶颈（genetic bottleneck）。遗传瓶颈与复制分离调控mtDNA遗传的数量和种类，造成子代间个体显著的差异，甚至单卵双胎儿也可能表现为不同表型[6]。

2 线粒体遗传病

其有广义和狭义之分，广义的线粒体遗传病是指由mtDNA、nDNA突变等遗传缺陷导致线粒体内酶或蛋白质缺陷，最终导致细胞功能损伤和临床症状甚至综合征，发病率约为1/10 000～1/5 000；狭义的线粒体遗传病是指mtDNA突变导致的母源性遗传病，通常所指线粒体遗传病即为狭义的线粒体遗传病。卵子的mtDNA突变通过母亲传递给子代，可引起母系家族性疾病，而生殖细胞核基因组上编码线粒体功能蛋白的基因突变也会遗传给子代，但是遗传方式并不确定，多为伴X连锁遗传。近年来，mtDNA突变与线粒体遗传病的研究备受关注。到目前为止，已经发现100多种与mtDNA突变有关的人类线粒体遗传病。线粒体遗传病多数是由mtDNA突变所致，mtDNA突变包括点突变、碱基缺失、重复以及mtDNA大片段的丢失等。辅助生殖门诊最常见的线粒体遗传病患者为线粒体脑肌病，主要包括Leigh’s综合征（LS）和线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征（mitochondrial encephalomyopathy with lactic academia and stroke-like episodes，MELAS），可能由于线粒体脑肌病发病早，患儿母亲尚有生育能力才会求助生殖门诊。LS好发于婴幼儿，首发症状主要表现为运动异常、眼部症状和癫痫发作，其特点是在磁共振成像下可见大脑坏死病灶，尤其是在中脑和脑干。LS具有年龄依赖性，呼吸链酶复合物基因变异是LS最常见原因，其中以SURF1突变最多，其次为m.8993 T＞C/G、m.14487 T＞C与m.13513 G＞A[7]，还有少见的m.11777 C＞A[8]，m.10191 T＞C[9]。MELAS典型发病年龄在2～15岁之间，也可能发生在婴儿期或成年；临床表现复杂多样，最初的症状可能表现为类似中风发作、癫痫、偏头痛、反复呕吐。类似中风发作伴有癫痫是MELAS的典型症状，可导致部分瘫痪、失明、局部神经缺陷，长期反复发作最终导致丧失运动功能、视力下降、身体的感觉功能丢失以及精神障碍如痴呆。MELAS患者的血液与脑脊液中常出现高水平乳酸堆积。MELAS表现为母源性遗传，由于mtDNA的缺陷引起，目前发现至少有17个不同的mtDNA突变会导致MELAS，最常见的是m.DNA3243 A＞G突变[10-11]。

到目前为止，线粒体遗传病无法治愈，只能依赖于缓解症状以及延缓病情进展的辅助治疗，因此预防显得更为重要。然而由于mtDNA的“遗传瓶颈”和“复制分离”等特征，即使携带低水平突变mtDNA的无症状携带者仍可能产生具有高突变负荷的卵母细胞从而使子代患病，此外，导致器官功能障碍和临床疾病表达的关键突变mtDNA阈值存在差异，因此，携带致病性mtDNA突变女性的生育遗传咨询非常具有挑战性，特别是低突变负荷的无症状携带者可以产生具有高突变负荷的卵母细胞。事实上，由于其后代中mtDNA异质性水平显著不同，携带致病性mtDNA突变妇女的遗传咨询进一步复杂化。

3 线粒体遗传病的产前诊断和PGT

目前用于预防线粒体遗传病的常规方法有产前诊断和PGT。产前诊断是一种在早期妊娠不同阶段对细胞进行采样的技术，突变mtDNA水平高时可选择终止妊娠，可降低子代患严重线粒体遗传病的风险[12]。线粒体遗传病具有很高的临床变异性，主要是由组织间突变负荷的变化所导致的。这种由于组织间变异性以及取样时胎儿发育阶段不同导致的mtDNA突变负荷差异使得产前诊断存在一定的风险。最新的研究发现当整个胎盘水平的平均突变负荷较低（＜20%）或较高（＞80%）时，不同部位样本的异质性分布是均匀的；反之，总体异质性在中等水平（20%～80%）时，突变负荷越接近40%～50%，异质性差异越显著，可高达43%，并且分布越广。羊膜细胞的mtDNA突变水平和脐带血细胞相似，但是与胎盘样本不同。因此，测定绒毛的突变mtDNA水平对某些线粒体遗传病进行产前诊断应谨慎，最好同时测定羊膜细胞mtDNA突变水平[13]。目前情况下，要想确定一个产前诊断的安全阈值，并确保该阈值之下的子代以后不会患线粒体遗传病，几乎不可能。而且产前诊断对于高水平突变mtDNA胎儿要进行引产终止妊娠，对孕妇和家庭伤害较大。

建立在IVF-ET基础上的PGT技术是指从早期胚胎中取出一个或多个细胞进行基因检测，选择无突变或低突变负荷的胚胎移植到子宫，逐渐被用于减少线粒体遗传病的风险[14]。2006年，Steffann等[15]报道了首例用卵裂球活检PGT技术筛选胚胎预防线粒体遗传病传递获得健康子代的成功案例，之后又有研究利用PGT技术预防特异性mtDNA突变，从而获得健康子代[16-19]。PGT涉及的胚胎活检主要包括卵裂期胚胎的卵裂球活检、囊胚滋养层细胞活检和极体活检等。研究发现2种mtDNA比例在成熟卵母细胞的卵胞质vs.极体、以及每个2-细胞、4-细胞、6-细胞和（或）8-细胞胚胎的卵裂球间的分布几乎是相同的，因此活检极体或卵裂球检测mtDNA异质性可以代表整个胚胎，但是极体活检结合卵裂球活检行PGT更为可靠[20]。也有研究发现活检不同阶段卵子或胚胎样本进行遗传学检测的可靠性不一致，滋养外胚层细胞mtDNA的异质性水平比第二极体更为接近胚胎干细胞的mtDNA异质性水平[21]，与卵裂期活检相比，滋养外胚层活检能够提高准确度而不降低胚胎发育潜能。近期一项研究认为单卵裂球活检PGT方案诊断m.3243A＞G突变错误率很低（0.34%）；鉴于植入前的早期胚胎中几乎不发生mtDNA复制[22]，并且mtDNA在子细胞中随机分布，因此认为这一结果与特定mtDNA突变无关，适用于所有mtDNA突变[23]。第1例胚胎活检移植了含有12%mtDNA突变负荷的胚胎，出生婴儿不同组织的突变负荷不到15%[16]。但另有对6周龄和18个月龄儿童的再分析显示，mtDNA突变负荷分别为42%和52%，并且该儿童患有复杂的神经性和多系统问题，但不是与m.3243A＞G相关的典型线粒体遗传病。

以上结果证实了PGT可以帮助选择突变mtDNA水平低的胚胎进行移植，是降低携带致病mtDNA突变女性后代患线粒体遗传病风险的可行选择。然而，到目前为止仍无法确定PGT用于预防线粒体遗传病的安全阈值，推测其他因素包括细胞核因素也可能起关键作用。此外，PGT并不是万能的，不适于只产生携带高水平突变mtDNA卵子/胚胎的患者。该问题突出了对可降低线粒体遗传病遗传风险的新型技术的需要，建立在核移植基础上健康线粒体捐赠技术为降低线粒体遗传病的传递风险带来希望。

4 线粒体置换技术在线粒体遗传病的应用价值及其局限性

mtDNA的母系遗传决定了突变的mtDNA只通过卵母细胞遗传给子代，那么如果能够减少卵子传递的突变线粒体、增加功能正常线粒体或者用健康的线粒体替换突变的线粒体，是不是可以有效减少甚至阻断突变mtDNA的遗传？基于细胞核移植基础上的线粒体置换减少卵子/胚胎中异常线粒体比例的线粒体捐赠（mitochondria donation）技术可有效减少致病mtDNA从母亲传递给子代，从而避免线粒体遗传病的子代出生，为线粒体遗传病的预防开辟了新天地。线粒体捐赠技术是基于核物质移植的生殖遗传技术，指用健康的线粒体替换线粒体遗传病患者或携带者的突变线粒体的方法，所诞生的子代常被称为“三亲”试管婴儿，即具有父母双亲的核遗传物质，又有第三方线粒体捐赠者的mtDNA。

迄今为止，各国科学家先后发明4种线粒体置换技术，是将线粒体遗传病患者卵子/受精卵的纺锤体-染色体复合物、第一极体、原核、第二极体等核物质移植到正常女性的去核卵/受精胞质中，获得的健康卵子与患者丈夫精子结合获得健康的胚胎，从而降低了后代患严重线粒体遗传病的风险。线粒体置换技术主要包括原核移植（pronuclear transfer，PNT）[24-25]、纺锤体-染色体复合物移植（spindle-complex transfer，ST）[26]、第一极体移植（firstpolar bodytransfer，PB1T）[27-29]、第二极体移植（second polar body transfer，PB2T）[26-27]等。PNT和ST是迄今为止研究最多的，有越来越多的科学数据证实这些核移植技术有预防线粒体遗传病的潜力。2016年英国国会已经通过立法，首先将ST与PNT技术用于预防严重线粒体遗传病的向子代传递。目前有研究报道了世界首例ST来源的“三亲婴儿”诞生[30]。该案例中携带m.8993T＞G致病mtDNA突变的女性经历了4次不明原因性流产，出生的2个孩子均死于高水平母系遗传的mtDNA变异导致的LS，该患者夫妇接受了纺锤体移植技术，选择了平均突变负荷为5.73%的ST男性胚胎进行移植，胎儿出生后多个组织平均mtDNA异质性水平是2.36%～9.23%，生后7个月时表现健康[30]。以上结果表明ST能有效地减少致病mtDNA突变的遗传，并且ST囊胚能正常发育、着床、产生子代。虽然ST能显著减少致病mtDNA的异质性，但仍可能会导致一定量的突变mtDNA残留，尽管在新生儿组织中报道的mtDNA残留量很低，仍不清楚突变的mtDNA是否会在不同组织中积累甚至发生mtDNA单倍型逆转，因此长期追踪随访出生子代健康对于评估线粒体置换的安全性和有效性极为重要。

虽然英国已经通过立法允许ST与PNT技术用于预防严重的线粒体遗传病向子代传递，但是线粒体置换技术的临床应用未能在国际上普遍获得立法。线粒体置换技术难以广泛应用于临床的核心问题是线粒体置换的安全性与“三亲婴儿”涉及的伦理问题。首先，线粒体置换技术涉及“核移植”，是否会像众所周知的体细胞核移植即“克隆”技术存在效率低、移植后流产率高、克隆动物寿命短死亡率高等严重的不良结局[31-33]？虽然极体基因组移植与体细胞核移植操作过程相似，但存在本质上的区别，线粒体置换是生殖细胞的核移植，生殖细胞不需要将一个已分化、高甲基化水平的体细胞重新编程恢复全能性，目前的研究未发现存在线粒体置换子代或胚胎干细胞存在遗传和表观遗传的异常[24-29]，但是长期安全性有待进一步研究。其次，社会各界担忧线粒体置换技术虽然使疾病线粒体的比例得到显著降低，但残余存在的少量致病mtDNA突变会不会继续复制扩增从而导致在子代中“复发”？目前公开发表的研究发现线粒体置换重构胚中即使携带极少量致病mtDNA残留都可能存在很大的潜在风险，即残留的突变型mtDNA复制、扩增的速率可能远超健康mtDNA，最终致病mtDNA的比例逐渐上升占主导地位，甚至发生mtDNA基因型完全逆转，导致线粒体遗传病再发[34-35]。这种现象亦被称为mtDNA单倍型漂移，具体的发生机制尚不清楚。最新的研究从12 975个个体（其中包含1 526对母子）中获得了高分辨率的异质性变异图谱，分析mtDNA异质性特征与nDNA的关系，发现微量的mtDNA能够转移到细胞核内，结果表明在具有不同线粒体与核祖先的人群中，最近的线粒体突变更倾向于在具有相同核祖先的群体中出现，而不是相同的线粒体祖先，这些结果表明细胞内mtDNA的变化可能是由nDNA决定的[36]。该研究为“线粒体置换治疗”选择健康线粒体捐赠者时进行mtDNA与nDNA的配型需求提供依据，以防止长期发育传代过程中的潜在健康问题。首例“三亲婴儿”诞生以后，引起医学大量伦理争议，支持者认为该技术能够挽救无数的患者和家庭；批评者认为这是不负责任、不符合伦理的行为，主要原因为该技术长期的、潜在的风险还不得而知[37]。那么，如何使线粒体捐赠者及受赠者、社会等认可并支持这一新兴技术用于阻断线粒体遗传病？仍需进一步深入研究，获得大量的线粒体置换基础研究与临床试验的安全性数据支持，经过国内外相关领域的专家进行全面的可行性论证，结合对社会各界进行深入调研、讨论、征询，最终形成草案等，推动该技术在我国的立法，走进临床，造福患者。

5 结语与展望

综上，线粒体遗传病女性患者的生育选择首先要先进行生育力评估与遗传咨询，对于卵巢功能低下的患者可选择领养孩子或接受供卵IVF-ET技术；对于可以产生携带低水平突变mtDNA胚胎的患者可以选择PGT结合产前诊断技术进行预防，极体检测结合卵裂球或者滋养外胚层检测可提高PGT的准确性。在我国尚未立法允许健康线粒体置换应用于严重线粒体遗传病情况下，有必要开展PGT与产前诊断技术预防线粒体遗传病的临床研究，建立临床上可行的线粒体遗传病的植入前与产前筛查技术体系，从而早日帮助线粒体遗传病患者获得健康子代。对于卵巢功能较好而只产生高水平mtDNA突变胚胎的线粒体遗传病患者，可以借助线粒体捐赠技术获得健康子代。但是线粒体置换技术临床应用前研究任重而道远，有必要在动物模型个体以及人胚胎干细胞水平深度解析线粒体置换重构胚中残留mtDNA的去向与长期稳定性，探索异源线粒体共存时线粒体漂移的发生机制及应对措施，不断提高与完善线粒体置换技术安全性与有效性，才能推动该技术的临床转化。