环境内分泌干扰物对早发性卵巢功能不全的作用机制研究进展

闻鑫，张跃辉，姚美玉

早发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）是一种卵巢功能提前衰退的临床综合征，患有POI的女性不仅会伴有生殖能力骤降和潮热、多汗、焦虑等围绝经期症状，还会伴有中枢神经系统、心血管系统、骨密度降低和代谢紊乱等多种因素导致的早死风险的增加[1]。POI发病率为1%～3%，累及约200万中国育龄期女性[2]，发病率有逐年升高且低龄化的趋势。已知的POI病因包括遗传因素、医源性因素、免疫因素，但大部分（75%～90%）病因不明确，为特发性POI[3]。有学者认为，特发性POI与环境、表观遗传修饰等因素密切相关。世界卫生组织（WHO）、联合国环境规划署（UNEP）、国际妇产科联盟（FIGO）已正式声明环境可对人类生殖健康产生不利影响， 证实环境内分泌干扰物（environmental endocrine disruptors，EEDs）对生殖功能异常、代谢紊乱及激素依赖性恶性肿瘤皆有致病性[4]。实验和流行病学研究发现EEDs可通过直接激活/灭活内分泌靶受体，或通过破坏激素的合成，或通过抑制/激活激素及其代谢酶干扰内分泌功能[5]。EEDs可通过食物、饮品、空气、生活用品、土壤及灰尘等介质经过消化系统、呼吸系统及皮肤黏膜等多种途径进入人体。随着EEDs的环境检出率和环境残留量逐年升高，其对生态环境和人类健康的威胁愈发受到世界各国的广泛重视。了解EEDs对POI的作用机制，有助于为POI的防治提供新的靶点。

1 EEDs的概念及分类

美国环境保护署（EPA）定义EEDs是一种可以干扰负责体内平衡、生殖和发育的天然血源性激素合成、分泌、运输、代谢、结合和消除的外源性物质。EEDs可以模拟或拮抗机体内源激素，在激素受体介导的信号传递中起激动剂或拮抗剂的作用，干扰激素稳态，在极低浓度下就能干扰内分泌系统的正常功能，其通过多种途径进入体内，直接或间接损害人类健康。

根据EEDs来源可分为：①家庭日常护理用品，如抗菌剂[三氯卡班（TCC）、三氯生（TCS）]、芳香剂多环芳烃类（PAHs）和紫外线吸收剂。②家庭常用工业产品，如塑料制品双酚A（BPA）、塑化剂邻苯二甲酸酯类（PAEs）[包括邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、酞酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP）]、脂溶剂多氯联苯（PCBs）、防护剂全氟烷基物质（PFAS）及阻燃剂多溴二苯醚（PBDEs）。③食品添加剂，如防腐剂对羟基苯甲酸酯。④不良生活方式，如烟草、酒精、玉米烯酮等。⑤农业用品，如杀虫剂拟除虫菊酯类、有机氯农药滴滴涕（DDT）、有机磷二嗪农（DZN）以及除草剂四氯二苯并二恶英（TCDD）。⑥药物，如解热镇痛药对乙酰氨基酚、镇痛药吲哚美辛，雌激素受体拮抗剂他莫昔芬、合成雌激素己烯雌酚（DES）、植物雌激素染料木黄酮（大豆异黄酮），中药材雷公藤等。⑦金属镉。此外，最新研究表明医源性途径如接触呼吸科、口腔科等含有EEDs的医疗器械也可发生EEDs暴露[6]。

2 POI与EEDs的流行病学关系

EEDs在POI的发生及发展机制中发挥重要作用，临床流行病学研究提示POI患者大多存在激素类药物使用史和烟草接触史（包括主动和被动），多项研究发现POI患者体内血清DEHP、BPA、PAHs等EEDs浓度较高。种类繁多的EEDs存在于现代人类生存的所有环境中，具有稳定性强、半衰期长、代谢缓慢、生物富集性等特点，可在自然界及人体内长时间存留。女性由于接触大量化妆品、个人护理用品等日化产品成为EEDs高暴露人群。EEDs暴露对女性的影响包括从胚胎期到成人期的各个阶段，而胚胎期至青春前期是发育最关键的敏感窗口，对EEDs暴露所导致的卵巢功能的早期破坏可在成年后以“剂量-效应”和协同作用的形式表现为生殖功能受损。Barrett等[7]评估了178例POI患者的血清PFAS水平，并证明血清PFAS与POI具有相关性。这些横断面调查数据表明EEDs暴露与POI的潜在联系，但暴露期间的发育窗口、EEDs类型、EEDs诱发POI机制并未阐明。

3 卵泡形成与POI发生机制

女性生殖健康取决于卵巢功能的正常发育，卵泡是卵巢的基本功能单位，卵泡的形成与发育直接影响女性的生殖能力。原始卵泡库的建立起始于胚胎时期，原始生殖细胞（PGCs）形成经历有丝分裂并迁移至生殖腺，之后快速地有丝分裂增殖导致细胞核分裂但细胞质分裂不完全的卵原细胞聚集后形成卵原细胞巢（oogonia cyst），其特征是多达30个细胞通过细胞间桥连接。在维甲酸（retinoic acid，RA）、激活素A（Act A）[8]等刺激下，有丝分裂的卵原细胞进入减数分裂并在减数分裂Ⅰ期的二倍体阶段停止分裂，成为初级卵母细胞。随着卵母细胞的发育，卵母细胞巢破裂（oocyte cyst breakdown，CBD）[9]。二倍体阻滞阶段的初级卵母细胞被周围单层的扁平颗粒细胞（GCs）包裹，从而完成卵泡组装，形成原始卵泡（primordial follicles，PFs）。前泡膜细胞被募集到PFs周围，PFs发育并向初级卵泡转化，但大多数PFs保持静止，构成原始卵泡池。与此同时，大部分卵母细胞经历程序性细胞死亡，这一过程包括自噬和凋亡。青春期后，PFs经激活及发育最终排出成熟的卵子或直接闭锁，这一过程为卵泡形成[10]。卵泡形成的任一环节异常都直接影响卵泡的发育、成熟，导致卵巢储备减少。妊娠20周时，发育中的胚胎卵巢包含的卵母细胞数量最初约为500万个，之后超过2/3的卵母细胞发生退化，在出生时留下的卵母细胞数量大大减少，约50～100万不等。虽然每次排卵前，都会有几个至几十个卵泡被激活并发育，但通常只有一个卵泡排卵释放出卵子，其余的卵泡则闭锁。女性一生会排出约400个卵子，约1%的卵泡构成了卵巢储备。原始卵泡池的大小代表女性的生殖能力。POI的基本病理机制是卵巢储备的提前衰竭，主要有两个原因：①胚胎期生殖细胞数量不足，导致卵巢原始卵泡池先天性较小；②卵巢储备的消耗加速，包括休眠的PFs激活增加和卵泡闭锁增强。

4 EEDs导致POI的作用机制

基础科学、动物模型和流行病学数据表明EEDs对女性生殖功能的损害机制复杂，不仅是由雌激素受体（ER）途径介导的，还可通过氧化应激、促进颗粒细胞凋亡、表观遗传修饰等多种机制，破坏卵巢储备建立（原始卵泡池的形成）和卵泡耗竭（卵泡募集、闭锁）之间的平衡[11]。卵巢储备和卵泡耗竭率是决定POI的关键因素，而影响这种平衡的因素最主要在卵泡形成的几个敏感窗口期，包括：PGCs发育期、减数分裂期、原始卵泡的形成、卵泡的募集和发育。本文将以卵泡形成过程的敏感窗口期为切入点，探讨EEDs对POI的影响机制。

4.1 对PGCs发育的影响 PGCs在外胚层形成后经历有丝分裂，向生殖嵴移动[12]，负责建立卵巢储备。扑热息痛以胚胎PGCs表达的环氧化酶2和前列腺素E2受体为靶点，干扰PGCs增殖。有研究表明，小鼠从交配后7 d（7 days post coitus，7 dpc）开始暴露于扑热息痛，PGCs有丝分裂活性明显下降，子代卵泡储备减少。PGCs的发展依赖于许多表观遗传变化，包括组蛋白修饰、X染色体活化、印迹消除和全局DNA去甲基化[13]，这对基因组的重新编程和种系的正确建立至关重要。越来越多的研究表明，PGCs分化早期暴露于EEDs可能会干扰表观遗传修饰，影响PGCs相关基因的表达。Zhang等[14]研究表明，妊娠小鼠0.5～12.5 dpc暴露于BPA可减少12.5 dpc胚胎PGCs印迹基因的DNA甲基化。另有研究表明，甲基化的Igf2r和Peg3印迹基因在接触BPA后发生去甲基化，此外，ERmRNA和蛋白的表达水平均增强。暴露于EEDs导致PGCs异常的甲基化状态可改变卵巢功能，如果这些修饰对生殖系产生稳定的影响，将促进卵巢功能改变的跨代遗传。多项研究报道，EEDs诱导的表观遗传修饰可被雌性大鼠向下一代遗传，影响表观遗传标记，而这些标记不会被表观遗传消除。Susiarjo等[15]研究了围生期暴露于BPA后多代代谢表型中的表观遗传失调的因果作用，早期BPA暴露可通过Igf2位点DNA甲基化的稳定遗传改变，在F1和F2代小鼠中发现了1个差异甲基化区域（DMR）的DNA甲基化改变，该区域调节Igf2印迹基因的表达，该基因是一种关键的胎儿生长促进因子，在代谢稳态中发挥作用。

4.2 对减数分裂的干扰 减数分裂是生殖细胞特有的过程，减数分裂的开始为卵泡形成的基础，正确的减数分裂过程对女性生殖细胞的质量和数量至关重要。在女性中，减数分裂开始于胚胎期，减数分裂异常可对生殖健康参数产生长期影响，如：重组缺陷可减少卵母细胞数量；缺乏REC8（内聚蛋白复合物的重要组成部分）可导致卵母细胞损失[16]；突触复合体蛋白3（SYCP3）表达改变可导致卵母细胞减少和非整倍体配子产生。有研究表明，BPA、DEHP以及药物扑热息痛和吲哚美辛都会干扰减数分裂，其机制包括干扰生殖细胞的减数分裂突触和同源重组以及延缓减数分裂进程等。Stra8是控制RA诱导卵母细胞减数分裂进入前期Ⅰ期的关键基因之一，通过上调DNA减数分裂重组酶1（DMC1）和减数分裂重组蛋白SPO11的表达促进突触复合体蛋白（SCPs）的表达，参与同源重组的启动。而敲除Stra8会影响卵巢储备的建立。研究表明，胚胎期暴露于DEHP的小鼠13.5 dpc的Stra8表达显著减少，17.5 dpc出现减数分裂延迟[17]。研究表明，妊娠小鼠每日灌胃BPA 0.02～0.08 mg/kg或DEHP 40 μg，可显著推迟减数分裂过程，减数分裂相关基因Stra8、DMC1、REC8、SYCP3表达明显减少。雌性大鼠胎儿暴露于扑热息痛（350 mg·kg-1·d-1，13.5～21.5 dpc）或吲哚美辛（0.8 mg·kg-1·d-1，15.5～18.5 dpc）后生殖细胞数量减少，这些不良影响是减数分裂延迟造成的，最终导致成年后卵巢质量下降和生育能力下降[18]。Liu等[19]研究表明，10 μmol/L或100 μmol/L DEHP暴露可抑制胚胎小鼠卵母细胞在减数分裂前期进展，特别是粗线双线期阶段，DEHP可损害减数分裂重组引起的DNA双链断裂的修复能力，从而激活粗线止点。此外，小鼠卵母细胞的体外实验表明，高浓度BPA可导致纺锤体异常、染色体聚集异常和减数分裂停滞[20]。在暴露于BPA的体外培养的人卵巢组织模型中也观察到同源染色体重组水平升高。已证明尼古丁可靶向作用于肌动蛋白丝，导致微丝紊乱和染色体分离，减数分裂过程中非整倍体增加率呈剂量依赖性，表现为不规则、畸形和多极纺锤体、染色体排列异常和微丝紊乱。

4.3 对原始卵泡池形成的影响 CBD和PFs组装是建立卵巢储备的前提。当卵母细胞达到前期Ⅰ期（二倍体期）末时，卵泡开始聚集。在啮齿动物中，CBD是由出生前后雌激素水平下降引起的，PFs组装过程中雌激素同样发挥重要作用，而具有雌激素样作用的EEDs可干扰正常雌激素信号传导，影响CBD和PFs组装。BPA的雌激素特性已被大量研究证实，当妊娠小鼠暴露于BPA时，可以观察到前期Ⅰ期的减数分裂进程受到抑制，CBD和PFs组装受到干扰。Zhou等[21]研究表明，子宫内BPA暴露可通过升高卵巢相关的抗凋亡因子水平、降低促凋亡因子水平来显著抑制CBD，从而减少原始卵泡池的大小。在小鼠胎儿中，母体内高雌二醇（E2）和孕酮（P）水平可抑制PFs组装，而出生前后类固醇激素水平的降低可促进PFs形成。对于人类而言，妊娠期雌激素水平的降低会抑制PFs组装。在一项对猕猴的研究中，从妊娠100 d到足月产，通过橡胶管持续暴露于BPA会破坏胎儿的PFs组装。可见EEDs对不同物种的干扰卵泡组装存在差异。除妊娠期暴露外，多项研究表明，新生儿暴露于EEDs会损害CBD和PFs组装。Zhang等[22]研究表明，新生小鼠卵巢体外暴露于10～30 μg玉米赤霉烯酮，与未暴露组相比生殖细胞数量显著减少。此外，玉米赤霉烯酮暴露以剂量依赖的方式降低Lhx8等卵母细胞特异性基因的mRNA水平，破坏小鼠PFs形成。另有研究证明BPA体外暴露可显著降低出生日龄（days post partum，dpp）为0 dpp的小鼠卵巢中CBD和PFs的百分比。

4.4 对卵泡募集和发育的影响 卵泡发育主要是指卵泡从原始卵泡到初级卵泡的转变过程。研究表明，一些生长因子可促进原始卵泡向初级卵泡转变，包括kit配体（KITL）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、白血病抑制因子（LIF）、生长分化因子9（GDF9）、骨形态发生蛋白15（BMP15）、基础螺 旋 环 转 录 因 子（FIGLA）、H1 连 接 组 蛋 白（H1FOO）、角化细胞生长因子（KGF）和基本成纤维细胞生长因子（bFGF）等。抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）家族成员髓样细胞白血病蛋白1（MCL1）近年也被证明是维持卵泡池、生长卵泡存活和卵母细胞线粒体生物能所必需的基本生存因子[23]。而某些因子如沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）、抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）等则可抑制卵泡发育。EEDs可通过调控这些因子对PFs的募集和发育产生影响，现将目前研究进展从卵泡募集、信号通路、激素代谢、卵泡闭锁及氧化应激5个方面归纳如下。

4.4.1 对卵泡募集的影响PFs作为卵巢储备功能的代表有3种结局：①处于休眠状态，构成卵泡池；②直接发生凋亡闭锁，导致POI；③从休眠状态激活，维持女性激素内环境平衡。静息、闭锁和激活之间的平衡对于维持生殖能力至关重要。青春期前EEDs暴露可通过增加PFs激活和生长中的卵泡闭锁来加速卵泡耗竭。DEHP及其主要代谢物邻苯二甲酸单乙基己酯（MEHP）被证实在体内外均可增加PFs激活和卵泡闭锁来促进卵泡募集，刺激卵泡和窦卵泡数量增加[24]。PCBs暴露可导致原始卵泡池先天缺陷并增加卵泡募集，导致卵巢储备过早耗竭。大鼠腹腔内注射高剂量（100 mg·kg-1·d-1）甲氧氯胺（MXR）可增加窦卵泡百分比，降低黄体百分比，这种效应与减少窦卵泡中ERβ和黄体生成激素（LH）受体的表达相关。Medigovi′等[25]在大鼠皮下注射50 mg/kg的染料木黄酮，观察到PFs数量减少，初级卵泡数量增加，提示PFs活化增加。

4.4.2 干扰影响卵泡发育的信号通路磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）是PFs募集的通路调节因子。DEHP和BPA可通过激活PI3K通路并减少其抑制基因表达，在卵泡发育早期增加原始卵泡池中卵泡的募集，导致PFs数量减少、生殖寿命缩短。蛋白激酶B（AKT）作为PI3K的下游调控靶点同样被证明与原始卵泡的募集有关，PI3K/AKT具有启动卵泡发育和GCs增长功能，还参与生殖细胞增殖、凋亡、DNA修复和蛋白质合成，这是一个动态、严格的调控过程。PTEN为PI3K/AKT上游的负调控因子，在PTEN敲除的小鼠中，磷酸化AKT（p-AKT）水平升高，整个原始卵泡池被激活，导致PFs耗竭。研究发现，在MEHP暴露的卵巢组织中，PTEN阳性的卵母细胞比例减少，而p-AKT阳性的卵母细胞比例增加，提示卵泡募集增加[26]。杀虫剂DZN暴露通过抑制PI3K/AKT通路诱导GCs凋亡和自噬，PI3K/AKT通路活性降低可促进促凋亡蛋白Bax转位至线粒体，并通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase3）途径释放细胞色素C触发生殖细胞凋亡[27]。此外，PI3K/AKT通路还可通过激活下游靶通路哺乳动物雷帕毒素靶蛋白（mTOR）和叉头框蛋白O（FOXO）调节卵泡发育。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种非编码RNA分子，可以通过转录后调节基因表达。DEHP和BPA可通过改变卵泡液中miRNA的表达，影响与卵泡发育和卵母细胞成熟相关的生物学通路[28]。

4.4.3 对激素代谢的影响EEDs可与类固醇激素受体或芳香烃受体结合，抑制并干扰激素的合成与代谢，进而影响卵泡发育[29]。DEHP暴露可竞争性地结合内源性ER，导致大鼠雌激素合成途径中断，血清睾酮水平降低，动情周期延长。同时负反馈作用于下丘脑-垂体-性腺轴（HPO轴），导致血清促性腺激素卵泡刺激素（FSH）水平升高、抑制素B（INHB）水平降低。而INHB水平降低和FSH水平升高是生殖衰竭的标志。此外，低水平的INHB可作用于卵泡膜细胞，导致脱氢表雄酮合成减少，进而引起卵泡数量减少和POI[30]。体外研究表明，拟除虫菊酯代谢产物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）、4-氟-3-苯氧基苯甲酸（4-F-3-PBA）和PAEs具有弱雌激素活性和抗雄激素效应。另有研究表明，拟除虫菊酯可降低大鼠卵巢GCs中LH诱导的P分泌，并干扰LH相关排卵基因的表达，抑制卵泡生长。吸烟可增加肾上腺产生雄激素，抵抗或削弱雌激素的功能，具有抗雌激素作用[31]。PAHs、MEHP和三唑类杀菌剂戊唑醇均可通过抑制芳香化酶mRNA转录水平，从而降低雌激素水平[7]。实验表明，DDT暴露对卵泡发育的抑制作用除通过与ER结合外，还可由其主要代谢物三氯乙烷（HPTE）刺激卵巢产生AMH，升高的AMH以局部旁分泌因子介导的途径抑制卵泡发育。

4.4.4 对卵泡闭锁的影响烟草作为最常见的EEDs之一，可通过促进PGCs凋亡来加速卵泡闭锁，从而导致POI。凋亡相关蛋白Bcl-2家族主要包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，两者比例的平衡维持正常的程序性凋亡。香烟烟雾中的有毒化学物质PAHs可激活GCs表面的芳香烃受体（AhR），该受体属于转录因子家族，与外源性配体结合后，AhR向细胞核转移，能够与DNA序列结合，诱导促凋亡蛋白Bax在卵母细胞中表达，增加卵母细胞凋亡率，促进卵泡闭锁，导致POI[32]。这是一个永久性且不可逆的致病机制，可以解释为什么有吸烟史的女性比从不吸烟者绝经提前。研究证实，暴露于烟草烟雾会导致卵泡发育各个阶段的卵泡损失，并且尼古丁对卵泡的损害存在“剂量-效应”趋势，吸烟强度、持续时间、累积剂量、开始吸烟的时间和戒烟年数与女性患POI的风险存在相关性[33]。植物雌激素的主要来源是异黄酮，其中最常见的是染料木黄酮。一项动物实验研究大豆异黄酮暴露对雌性大鼠从哺乳期到性成熟的影响，证实大豆异黄酮在提升卵泡募集速度的同时可以促进GCs凋亡，最终导致卵泡闭锁。最新研究表明，miRNA在卵泡的胞内和胞间通讯中发挥重要作用，可以影响GCs功能，改变卵泡发育和卵母细胞成熟。Martinez等[28]研究表明，miRNA的表达与酚类和邻苯二甲酸盐代谢物的浓度有关，miR-375在GCs和卵母细胞中均有表达，miR-375过表达可抑制GCs中E2的产生和卵泡发育，增加卵母细胞和GCs的凋亡率。

4.4.5 氧化应激损伤EEDs影响卵泡发育的另一种机制是氧化防御失衡和氧化应激导致细胞死亡。当调节活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平的细胞机制被破坏并导致ROS失衡时，ROS积累会损害卵巢功能。Ma等[34]通过皮下注射雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）建立POI小鼠模型，与正常对照组相比，TG组血清AMH水平显著降低，同时，TG组血清和卵巢匀浆中丙二醛（MDA）水平、MDA5和NADPH氧化酶亚基gp91phox表达水平均升高，总抗氧化活性（total antioxidant activity，TAC）及抗氧化物超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平均降低，且TG组caspase3、Bax等促凋亡蛋白水平升高、抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。提示TG导致POI的机制是通过增加氧化应激和诱导细胞凋亡。线粒体内膜的呼吸链是产生ROS的主要来源，当电子传递链被抑制时，ROS的产生明显增加。ROS的积累可损伤线粒体，引起细胞凋亡。有机氯杀虫剂甲氧滴滴涕（MXC）具有线粒体复合物Ⅰ抑制剂活性，通过抑制复合物Ⅰ，引起卵母细胞中线粒体的氧化应激反应。Gupta等[35]研究表明，与对照组相比，暴露于MXC（1～100 μg/mL）可显著抑制线粒体呼吸，增加ROS和过氧化氢（H2O2）的产生，并降低卵巢中抗氧化剂硝基酪氨酸和8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHG）、SOD1、GSH-Px和过氧化氢酶（CAT）的表达和活性，自由基产生和清除失衡，抑制卵泡的生长，导致卵泡过度闭锁。另有研究证明，三邻甲苯基磷酸酯（tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）可通过诱导小鼠卵巢组织及GCs发生氧化应激而导致过度自噬并造成损伤。暴露于10 mg/L的DEHP可显著增加ROS水平，并降低SOD1活性，抑制次级卵泡生成。六价铬（CrⅥ）通过增加细胞色素C和降低caspase3水平来增加线粒体介导的凋亡，同时减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，增加卵泡闭锁[36]。

5 结语与展望

现代社会的工业化显著增加了EEDs暴露的风险，威胁人类的生殖健康，干扰内分泌和生殖功能[37]。随着二胎政策的放开及婚育年龄的推迟，POI的防治工作是生殖领域亟需解决的难题之一，EEDs对人类生殖健康的潜在威胁不容小觑，但由于EEDs种类繁多且从胚胎期始便暴露于女性一生，其对POI的作用靶点尚不完全清楚，需要进一步深入研究以最大程度地减少EEDs对人类生殖健康的威胁。探究EEDs暴露与女性POI的相关性可为更全面地评价其健康风险提供科学依据，以便更早地识别有POI风险的患者，限制加重因素，尽早采取生殖保护性措施，从源头上降低POI的发生风险，对于加强这类化合物风险管理和保障女性生殖健康具有重要的科学意义和社会意义。