阻断双侧终板营养途径构建山羊椎间盘退变模型

尹 思，杜 恒，赵为公，麻少辉，张 明，管 民，刘 淼

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)可引起椎间盘突出、脊柱失稳、椎管狭窄、椎间盘源性腰痛等疾病，已成为中老年病残和生活质量下降的主要病因[1]。IDD具体发病机制尚不明确，营养物质的减少被认为是诸多因素中的最终途径[2]。研究[3-4]证实椎间盘营养障碍会导致IDD，但是对于阻断椎间盘终板营养途径是否会造成IDD的发生，目前的研究结果存在争议。Hutton et al(2004年)通过阻断狗的单侧终板营养途径，70周后解剖学、形态学和影像学检查均未发现明显IDD的征象，而酶联标记免疫吸附测定发现髓核和纤维环中蛋白多糖含量显著增加。Kang et al[5]在未成熟猪的动物模型中，通过骨水泥注射的方法阻断双侧椎板营养途径长达3个月，影像学和组织学检查证实阻断营养途径后的椎间盘较对照组发生显著的退变表现。本实验于2017年4月～2018年10月在西安交通大学第一附属医院实验室完成。通过建立山羊椎间盘双侧终板营养途径阻断的动物模型，观察IDD的情况，研究椎间盘终板营养途径与IDD的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取来自同一畜牧区相同品种的雌性健康清洁级关中山羊8只(由西安交通大学医学院动物中心提供)，24月龄，体重35～45 kg。检疫合格，无任何畜类疾病及传染病，标准饲养条件下适应性饲养2周。本研究中动物实验已被西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准实施，并遵守相关实验动物饲养与使用指南。实验过程中遵守实验动物伦理原则，尽可能减少实验动物的痛苦，妥善处理动物尸体。

1.2 山羊双侧终板营养途径阻断的动物模型建立术前禁饮食24 h，术前30 min肌注阿托品0.05 mg/kg和地西洋10 mg。基础麻醉并行气管插管，山羊右侧卧位，头部略低于躯干，以最末一节肋骨下缘、髂嵴上缘、腰椎横突下4 cm、腰椎横突为边界的矩形区域剃毛备皮、消毒。自山羊末肋下缘为起点，旁腰椎横突外2 cm的纵线为切口，长约10 cm。依次切开皮肤、皮下组织、腹外腹内斜肌，经左侧腹膜外入路暴露腰椎间盘，避免损伤椎体周围组织和腰横动、静脉。以L2～3、L3～4为实验椎间盘。平行于椎间盘上、下终板约2 mm处用骨刀和摆锯在椎体开槽，宽2～3 mm，将椎体松质骨切除，仅保留骨皮质。骨缺损处用聚甲基丙烯酸树脂(PMMA)骨水泥填塞，骨水泥量≤2 ml，阻断椎体和终板之间的营养通路。见图1。L1～2、L4～5未损伤椎间盘作为正常对照。操作完成后逐层缝合伤口。待动物麻醉作用消失后，拔出气管插管并肌注地塞米松5 mg。术后1～3 d每日肌注青霉素180万单位，术后常规饲养。

图1 山羊双侧终板营养途径阻断模型的建立A.显露腰椎椎体及椎间盘；B.平行于终板2 mm处截骨(箭头为截骨处)；C.骨缺损处注射骨水泥填充(箭头为骨水泥)；D.截骨骨板

1.3 影像学评估实验动物于术后4、12、24、48周随机选取2只。基础麻醉后将山羊置于侧卧位摄腰椎侧位X线片。使用Philips Intera Achieva 1.5 T双梯度磁共振系统行腰椎MRI检查。采用SENSE相共振体线圈包裹羊腰椎，侧卧位，尾先进，先行T2WI-TSE-SPAIR(TR/TE=3 500 ms/60 ms，层厚/层间距=4.0 mm/0.6 mm，扫描时间为3 min 31 s)扫描，然后进行矢状位T1-TSE-SPIR(TR/TE=400 ms/7.8 ms，层厚/层间距=4.0 mm/0.6 mm)平扫。根据X线片结果测量椎间隙高度变化，计算椎间高度指数(disc height index,DHI)，即椎间盘前、中、后平均高度除以相邻两椎体高度。前后椎间高度的变化以DHI百分比(DHI%)表示，DHI%=(术后DHI/术前DHI)×100%。根据椎间盘MRI在T2WI矢状面的信号及形态，IDD的分级采用Pfirrmann分级评分方法：正常Ⅰ级(1分)；轻度退变 Ⅱ级(2分)；中度退变 Ⅲ级(3分)；重度退变Ⅳ级(4分)；严重退变Ⅴ级(5分)。

1.4 骨水泥有效阻断面积的测定于术后4、12、24、48周各随机选取2只山羊，行影像学检查后通过吸入过量乙醚的方法执行安乐死，同时取出L1～2、L2～3、L3～4和L4～5共8个椎间盘(包括4个两侧阻断营养通路的椎间盘、4个正常对照的椎间盘)。将椎间盘行脱钙处理和石蜡包埋。脱钙后的组织标本用锯片和切片刀沿骨水泥与终板之间的界面将椎间盘与椎体分离，再将骨水泥从椎体上剥离。分别对邻近终板侧的椎体断面和骨水泥进行等距离、等倍数的数码拍照。将数据用CAD软件进行处理，分别计算出椎体和骨水泥的横断面积，计算骨水泥有效阻断面积。有效阻断面积=(头侧椎体横断面积+尾侧椎体横断面积)/(头侧骨水泥横断面积+尾侧骨水泥横断面积)×100%。

1.5 组织学检查椎间盘组织行脱钙处理和石蜡包埋后切片，每张厚度4～6 μm，分别行HE染色、Masson三色染色、蛋白多糖染色、番红O染色。

2 结果

8只山羊均顺利完成实验，手术及麻醉过程平稳，术后没有发生呼吸困难、脱水、肠胀气或伤口感染等副反应事件。

2.1 骨水泥有效阻断面积见表1。在建立山羊双侧终板营养途径阻断的动物模型过程中，经大体标本验证8只山羊均是距终板1～2 mm处行椎体松质骨切除，切除范围为椎体中心区域的骨质，骨水泥分布均匀，无渗漏。骨水泥有效阻断面积为49.6%～69.6%(60.7%±5.3%)。

2.2 影像学结果见表1。术后48周时，DHI%实验椎间盘为60.5%～81.7%(72.7%±5.6%)，对照椎间盘为79.4%～93.8%(86.5%±4.6%)；椎间盘退变Pfirrmann分级评分实验椎间盘为3～5(4.0±0.7)分，对照椎间盘为1～2(1.4±0.5)分，两者两项比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.3 组织学结果见图2。

2.3.1HE染色 ① 对照椎间盘：髓核基质均一，脊索及类软骨细胞形态正常、细胞分布均匀，胶原纤维排列整齐，层次分明，纤维环和髓核联系紧密，脊索及类软骨细胞丰富；软骨终板细胞排列整齐、细胞核清晰。② 实验椎间盘：术后12周髓核出现皱缩或干瘪、变小、纤维化，纤维环和髓核分界不清。髓核基质分布不均一，脊索及类软骨细胞分布不均匀；软骨终板细胞排列紊乱、细胞核存在，血管增生。术后24周可见髓核基质不均一，脊索及类软骨细胞减少，纤维样细胞增多；软骨终板区血管增生，软骨细胞核模糊、消失，只剩轮廓。术后48周可见髓核基质明显不均一，脊索及类软骨细胞明显减少；软骨终板区血管增生，钙化、纤维细胞增生，软骨细胞消失。

表1 山羊双侧终板营养途径阻断48周后的骨水泥有效阻断面积、DHI%和Pfirrmann分级评分

图2 山羊双侧终板营养途径阻断实验术后12、24、48周和正常对照的不同组织学结果A.正常对照；B.实验12周；C.实验24周；D.实验48周；① 髓核组织HE染色×100; ② 软骨终板HE染色×200; ③ Masson三色染色×100；④ 蛋白多糖染色×200；⑤ 番红O染色×100

2.3.2Masson三色染色 ① 对照椎间盘：髓核胶原纤维排列整齐，层次分明，纤维环和髓核联系紧密。② 实验椎间盘：术后12周髓核胶原纤维排列欠整齐，层次尚分明；术后24周髓核胶原纤维排列紊乱，层次欠分明；术后48周髓核胶原纤维排列紊乱，不均一，纤维环和髓核间出现裂隙。

2.3.3蛋白多糖染色 ① 对照椎间盘：髓核蛋白多糖染色均一，排列整齐，脊索及类软骨细胞分布均匀、形态正常。② 实验椎间盘：术后12周髓核蛋白多糖染色不均，排列不整齐，脊索及类软骨细胞减少；术后24周髓核蛋白多糖染色明显变淡，排列较紊乱，脊索及类软骨细胞有所减少；术后48周髓核蛋白多糖染色出现裂隙，排列紊乱，脊索及类软骨细胞明显减少。

2.3.4番红O染色 ① 对照椎间盘：髓核胶原纤维排列整齐，层次分明，脊索及类软骨细胞丰富。② 实验椎间盘：术后12周髓核胶原纤维排列不整齐，染色欠均一，脊索及类软骨细胞较多；术后24周髓核胶原纤维排列不整齐，染色不均一，脊索及类软骨细胞减少；术后48周髓核胶原纤维排列紊乱，出现裂隙，染色明显不均，脊索及类软骨细胞明显减少。

3 讨论

椎间盘的营养通路主要有两种：一是终板营养途径，椎体内血管的营养物质通过骨髓腔-血窦-软骨终板扩散到椎间盘，营养髓核及纤维环内层，此途径是椎间盘营养的主要途径[5]；二是纤维环营养途径，营养物质从纤维环表面的血管扩散进入纤维环外层，营养范围相对较局限[3]。当上述环节中的任何一环发生问题时，椎间盘的营养就会受到影响。目前阻断终板营养途径的动物模型多为单侧阻断模型，且阻断后对IDD的影响也存在争议[5-6]。本研究建立山羊椎间盘双侧终板营养途径阻断的动物模型，利用PMMA骨水泥注入的方法成功阻断终板营养供应，有效阻断面积达60.7%，并通过影像学和组织学评估证实椎间盘终板营养途径与IDD的相关性。

理想的IDD动物模型应具有以下特点：① 所选动物解剖和生理特点尽可能与人类近似；② 能再现IDD的客观规律；③ 模型重复性好[7-8]。本实验选用24月龄的山羊，其生理年龄相当于人青春期，体格发育完善，椎间盘未出现退变，可较好地模拟IDD的过程。前期研究[9]通过对山羊腰椎结构的解剖和MRI动态增强扫描分析，证实山羊腰横动脉分布于椎体中部，且营养物质通过骨髓腔-血窦-软骨终板界面弥散到髓核，为建立双侧阻断终板营养途径的山羊动物模型提供了实验解剖和影像学基础。

阻断双侧终板营养途径的山羊动物模型的设计原理是在不影响脊柱稳定性的前提下，避免生物力学方面对椎间盘营养及代谢造成的影响，进行终板营养阻断，进而促进IDD发生。因此，选用合适的阻断物对于实验结果的准确性和可信度至关重要。本实验选用PMMA骨水泥作为阻断终板营养途径的阻断物，不仅可以有效地阻断椎体与终板之间的血液供应，而且利用骨水泥的强度可以保证椎体的完整性和力学强度[10-11]。另一个需要关注的问题是PMMA骨水泥的聚合反应所产生的热量是否会造成椎间盘和终板的热损伤，进而引起椎间盘和终板的退变，对实验结果造成影响。聚合热的高低与环境温度、周围组织结构、骨水泥初始温度、体积、厚度等因素有关。Lai et al[12]报道在行椎体后凸成形术时，椎体前、后皮质和椎间孔的峰值温度不超过45 ℃，不会对周围软组织造成直接的热损伤。邓忠良 等[13]在骨质疏松的患者中行椎体成形术过程中用计算机控制热电偶型温度传感穿刺针动态检测骨水泥表面部位温度变化，注射骨水泥平均3.1 ml，峰值温度为38.5～40.0 ℃，持续时间0.5～2.5 min，且峰值温度与注射剂量呈正相关，上述温度均低于组织蛋白热凝固的温度(47～56 ℃)。本实验中，在确保有效阻断椎体与终板间血供的情况下，骨缺损的厚度≤3 mm，骨水泥注射的体积≤2 ml，以确保椎体、终板及髓核不受到聚合热的损伤。

终板阻断的部位和阻断面积是建立终板营养途径阻断的动物模型成功与否的重要因素。研究[14-15]证实髓核的营养供应主要依靠终板中央区域血管的弥散作用。因此，为有效地阻断通往髓核的营养供应途径，就必需阻断椎体和终板之间的血液供应，尤其是终板中心区域。而在本研究建立动物模型过程中，术者在术中将距终板1～2 mm椎体中心区域的髓腔骨质切除，并用PMMA骨水泥注射填充，其平均阻断面积达60.7%，显著高于先前文献报道[5]的阻断面积(38.92%)，因此从理论上证明能够确实有效地阻断终板营养途径。本实验在建立山羊动物模型的基础上，成功阻断双侧终板营养途径48周后，通过影像学和组织学评估证实椎间盘营养和IDD的相关性。术后48周时实验椎间盘的椎间高度丢失和Pfirrmann退变分级评分均显著高于对照。HE染色、Masson三色染色、蛋白多糖染色、番红O染色等多种组织学检查也均证实了阻断双侧终板营养途径后IDD的发生，包括纤维环塌陷、脊索及类软骨细胞的减少、1型胶原的增加和2型胶原的减少等，且随时间延长逐步加重。

本研究建立了阻断双侧终板营养途径的山羊IDD的动物模型；骨水泥注射填塞48周后影像学和组织学结果证实阻断终板营养途径可以导致IDD的发生。本研究的局限性：实验中未设置如纤维环穿刺等阳性对照，且阴性对照选择了同一动物体内的相邻节段椎间盘，而非不同动物的相同节段椎间盘；这些会一定程度地影响实验结果的可靠性。在今后的研究中，以建立的阻断双侧终板营养途径的动物模型为基础，可以开展一系列椎间盘退变相关的基础研究，包括利用动态增强MRI技术研究毛细血管网灌注与软骨终板弥散的相关性、软骨终板退变或钙化导致IDD的机制研究等，为深入研究IDD的发病机制、提升椎间盘退变性疾病的临床治疗水平奠定基础。