腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中的应用研究

战晓燕 刘志国 毕天明 马 静 张红巍 薛德林，4⋆

1 上海农林职业技术学院 上海 201699

2 辽宁威兰生物技术有限责任公司 沈阳 110033

3 北京春旭生物科技有限公司 北京 100032

4 中国科学院沈阳应用生态研究所 沈阳 110016

腐植酸是一种广泛存在于自然界中结构复杂、功能活跃的混合物。由于腐植酸具有特殊的分子结构和生物学功能，作为饲料添加剂在水产养殖的淡水、海水中应用已取得很好的使用效果[1～10]。本文对含腐植酸钠的腐植酸饵料添加剂在虾池中喷洒，辅助喷洒枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、海洋红酵母、光合细菌，对南美白对虾工厂化淡水养殖中的应用效果进行研究，旨在为含腐植酸钠的腐植酸饵料添加剂和微生物制剂在南美白对虾的工厂化循环水养殖中的应用提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

（1）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 2018），从辽宁大连黄海海域底泥中分离得到。

（2）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CICC 1421），从中国工业微生物保藏管理中心购买。

（3）嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus CICC 6074），从中国工业微生物保藏管理中心购买。

（4）海洋红酵母（Marine red yeast 2019），从辽宁大连渤海海域海参养殖圈中分离得到。

（5） 光 合 细 菌（Photosynthetic bacteria 2019），从辽宁大连渤海海域海参养殖圈中分离得到。

1.1.2 供试原料

（1）腐植酸钠，从内蒙古霍林河郭勒树艳腐植酸公司订购。水溶性腐植酸含量（干基）≥60%～70%，细度≤80 目，水分≤10%，pH=8.5。

（2）豆粕，黑龙江省九三油脂集团生产，市售。颜色为浅黄色至浅褐色，具有烤大豆香味，成分：蛋白质50%，赖氨酸3.0%，色氨酸0.7%，蛋氨酸0.7%，水分≤10%。

（3）精氨酸菌泥粉，从河北精晶药业科技股份公司订购。蛋白质含量≥52%，碳水化合物（糖）含量≥8.0%，总磷含量≥1.0%，灰分含量≤5.0%，水分含量≤8.0%，细度≤100 目。

（4）麦麸皮，黑龙江八五零农场生产，市售。小麦加工的主要副产物。

（5）大米糠，黑龙江八五零农场生产，市售。稻米加工的主要副产物。

（6）啤酒酵母泥，沈阳盛京啤酒有限公司集团生产，市售。啤酒发酵过程中的主要副产物，成分为：蛋白质60%，赖氨酸5.0%，色氨酸1.0%，蛋氨酸0.9%，水分≤50%。

1.1.3 供试设备

发酵罐，镇江双瑞生物设备有限公司生产；固体发酵机组，中国水产科学院上海渔用机械研究所研制生产。

1.1.4 供试苗种

南美白对虾：由广东海大水产生物科技有限公司繁育，市购。

1.2 腐植酸饵料添加剂产品制备工艺

腐植酸饵料添加剂产品制备工艺：液体发酵菌种→固体发酵物料→烘干粉碎物料→产品保证值检测。

（1）液体发酵菌种工艺过程：1 支试管斜面→1 瓶1000 mL 三角摇瓶（摇床培养24 h）→1 t种子罐（24 h）→10 t 发酵罐（36 h）。

将选用的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、海洋红酵母和光合细菌分别在各自的种子罐、发酵罐中培养，各种菌所选用的发酵培养基、发酵条件及发酵结果见表1。

（2）固体发酵物料工艺过程：2 t 旋转蒸球高温高压处理固体发酵物料（腐植酸钠、豆粕、麦麸皮、大米糠）→物料冷却后与发酵菌液（精氨酸菌泥粉、啤酒酵母泥、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌）混合→传送带机械铺料→采用流动履带式全自动发酵机组发酵。

（3）烘干粉碎物料过程：传送系统→负压式低温真空流化床→传送系统→大型微粉机械→多级筛过筛→传送系统→成品包装→质检→腐植酸饵料添加剂产品。

（4）产品保证值检测：粗蛋白检测按照国家标准GB/T 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法进行测定；小肽检测按照国家标准GB/T 22492-2008 大豆肽粉中，饲料中酸溶蛋白的测定方法进行测定，小肽分子量小于2000 道尔顿；总酸检测按照国家标准GB 5413.34-2010 食品安全国家标准 乳和乳制品酸度的测定对饲料中总酸进行测定；氨基酸检测按照国家标准GB/T 18246-2000 饲料中氨基酸的测定进行测定；挥发性盐基氮检测按照国家标准GB/T32141-2015 饲料中挥发性盐基氮的测定进行测定；含水量检测按照国家标准GB/T 6435-2014 饲料中水分的测定方法进行检测。

1.3 试验设计

1.3.1 南美白对虾工厂化淡水循环水养殖

（1）试验养殖池布置。

4 个试验组和1 个对照组各设置3 个养殖池，共设置15 个养殖池，每个养殖池的水体体积为6.0 m×5.0 m×1.2 m ＝36.0 m3，周边为圆角，水体总体积540.0 m3，随机排列，具体试验设计如表2。

表2 试验设计Tab.2 The design of experiments

（2）试验养殖池投饵量及投饵方式。

投饵量：按照且参考南美白对虾日投饵量表3进行。

表3 南美白对虾日饵料投喂量参考表Tab.3 Reference table for feeding amount of P. vannamei bait

投饵方式：每天投饵6 次，从早晨6：00 开始，每隔3 h 投喂1 次，到晚上6：00 后隔6 h 投喂1 次。将饵料按照规定投饵量放入到喂料盆中，用手将饵料均匀地投撒在养殖池中的饵料盘中。观察南美白对虾的采饵情况、生长情况，并且做好观察记录。

（3）试验养殖池中微生物制剂的投放剂量和投喂方式。

各试验组和对照组均按照试验布置的用量，在早晨6：00 首次投饵前，将腐植酸饵料添加剂和微生物制剂均匀地投撒到养殖池中，试验期内每5 天投洒1 次，共应用12 次，使用量按照表2 进行。对照组投撒同体积同质量水。

投喂饵料：养殖池48 h 前全部投喂卤虫幼体，48 h 后开始投喂开口饵料，按照15 克/万尾的量投喂，此后按前1 天的10%增加饵料量，每天喂6 次。

（4）试验养殖池水体的处理方式。

养殖试验池设在内陆省份，距海岸线600 km，需要采用海水逐级淡化养殖模式。

储水池水质处理：将井水抽到储水池中，随之用5 ppm 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）络合水体中重金属离子。用海水晶模拟海水，将水体中的盐度调整到虾苗所需要的浓度。将调整好的养殖水，沉淀24 h 后通过膜过滤分别流入到试验池中，池水深0.5 m，放入养殖水后，再一次确定放苗前养殖水的水质指标：盐度15‰，溶氧量8 mg/L，温度25 ℃，pH 8.4，当虾苗生长所要求的指标基本一致时即可放苗。

第一次放苗的密度（标苗期）：广东海大水产生物科技有限公司仔虾苗（育苗期为20 天），每一个池子放苗数为：20 万尾/36 立方米。

第二次放苗的密度（养成期）：虾苗重量为3000 尾/公斤，大约4 厘米/尾时开始分苗，分完苗后放苗密度为700 尾/立方米，试验养殖池水体按照36 m3计算，实际放苗密度25200尾/36立方米。

放苗结束后，通气，投料，投饵量按照南美白对虾日饵料投喂量参考表投喂进行。

1.3.2 试验时间、地点、管理

试验时间：标苗期2018 年10 月1 日—30 日；养成期2018 年11 月1 日—30 日。

试验地点：河南省新乡市长垣县鸿志农业与华大基因组合作水产养殖基地。

日常管理：按照试验设计投撒腐植酸饵料添加剂和微生物制剂、投饵、换水等项管理措施，按照正常管理进行。

南美白对虾最适生长温度为25±1 ℃，最适生长盐度为15‰，通过逐级稀释盐度的方法养殖，可以稀释到1‰～2‰，且可在淡水中正常生长。

南美白对虾养殖池水淡化：自投苗的第3 天起，每天上午添加淡水使水位上升10 cm。到加水的第5 天，池水水位加至100 cm，然后每天上午先排池水使水位下降10 cm，接着加淡水使水位上升5 cm，下午再加淡水使水位上升5 cm，仍维持池水当天水位不变，这样在池水淡化的13 天内，使池水盐度每天约降低1‰～2‰。当池水盐度降至3‰时，每天上午排池水20 cm，当天上、下午各加淡水10 cm，始终保持水位不变，待池水盐度降到0.5‰。营造南美白对虾适宜的生长条件，每7 ～10 天，根据检测结果定期补钙、镁、钾和微量元素、多种维生素等。

南美白对虾循环水池水处理程序：养殖池排出的水进入循环水池，通过向内接入大量的芽孢杆菌、硝化细菌、反硝化细菌、光合细菌等菌株，再通过增加循环水池中的通气量，对循环水进行处理，使得池中的生物耗氧量和化学耗氧量达到正常的指标。

1.3.3 测定指标及经济效益计算

虾苗成活率：表示成活的虾苗数量占虾苗总量的百分数，即成活率（%）=成活的数量÷总数量×100。

虾苗增长率：即虾苗体长增加率，表示体长增加的长度占体长原长度的百分数，虾苗体长增加率（%）=体长增加的长度÷体长原长度×100。

饵料系数，即料肉比（FCR），是指饲养的动物增重一单位重量所消耗的饲料的重量。饵料系数（料肉比）=饵料消耗量/增重量×100%。

经济效益分析：按照经济效益计算公式，试验净效益（产出）=试验增加收入-试验投入费用。

试验增加投入成本：腐植酸饵料添加剂和微生物制剂所投入费用。

1.4 南美白对虾工厂化淡水养殖中水体理化指标 测定

溶解氧：采用国际标准ISO-5813-1983 水质溶解氧的测定碘量法标准。

pH：使用玻璃电极法进行检测。

透明度：采用塞氏盘测定方法进行。

浊度：按照国家标准GB/T 13200-91 水质浊度测定进行检测。

氨态氮：按照国家标准GB/T 5750.5-2006 生活饮用水标准检验方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 腐植酸饵料添加剂生产

2.1.1 液体发酵

按表1 选用的培养基、发酵条件，经36 h 发酵，可生产出枯草芽孢杆菌≥2×1010cfu/mL、酿酒酵母≥3×109cfu/mL、嗜酸乳杆菌≥7×109cfu/mL、海洋红酵母≥3×109cfu/mL、光合细菌≥5×109cfu/mL的菌液。

2.1.2 固体发酵

将腐植酸钠30 份、豆粕20 份、精氨酸菌粉20 份、麦麸皮10 份、大米糠10 份、啤酒酵母泥10 份，以枯草芽孢杆菌15 份、嗜酸乳杆菌15 份、酿酒酵母菌15 份为发酵菌种，混拌均匀后放入DL-带式发酵干燥机，经100 h 兼性厌氧—厌氧—好氧发酵，再经流化床低温干燥，粉碎300 目，得腐植酸饵料添加剂。

2.1.3 腐植酸饵料添加剂的产品保证值

通过腐植酸饲料添加剂产品工艺生产出的腐植酸饵料添加剂产品保证值及与腐植酸的区别见 表4。

表4 腐植酸饵料添加剂产品保证值及与腐植酸的区别Tab.4 The difference of humic acid bait additives products guarantee value and humic acid

2.2 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾 工厂化淡水养殖中的应用效果

腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中的应用效果，见表5 ～表8。

通过表5、表6 结果可以看出，经过（标苗期）30 天的试验，结果表明：试验组1 与对照组相比，南美白对虾成活率提高4.50%，增长率提高0.33%，日增重提高0.125 kg/36 m3，区组间试验增重率7.03%，饵料系数降低0.0200；试验组2 与对照组相比，南美白对虾成活率提高3.50%，增长率提高0.33%，日增重提高0.101 kg/36 m3，区组间试验增重率5.68%，饵料系数降低0.0203；试验组3 与对照组相比，南美白对虾成活率提高6.50%，增长率提高0.67%，日增重提高0.158 kg/36 m3，区组间试验增重率提高8.33%，饵料系数降低0.031；试验组4 与对照组相比，南美白对虾成活率提高9.00%，增长率提高1.00%，日增重提高0.190 kg/36 m3，区组间试验增重率10.69%，饵料系数降低0.030。观察虾苗的活力、体力、体色和虾壳质量，4 个试验组明显好于对照组。

经方差分析南美白对虾（标苗期）30 天试验的平均重量结果：试验组1 与对照组比较：P=0.0025，P ＜0.01，差异极显著；试验组2 与对照组比较：P=0.0039，P ＜0.01，差异极显著；试验组3 与对照组比较：P=0.0002，P ＜0.01，差异极显著；试验组4 与对照组比较：P=0.0004，P ＜0.01，差异极显著；试验组3 与试验组4 比较：P=0.1170，P ＞0.05，差异不显著。

表5 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中成活率与体色、虾壳质量的影响（标苗期）Tab.5 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on survival rate, body color, shell quality of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the seedling stage)

表6 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中日增重与饵料系数的影响（标苗期）Tab.6 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on daily weight gain and feed coefficient of P. vannamei in industrial freshwater aquaculture (the seedling stage)

由表7、表8 可知，经过（养成期）30 天的试验，结果表明：试验组1 与对照组相比，南美白对虾成活率提高3.00%，增长率提高0.06%，日增重提高0.676 kg/36 m3，区组间试验增重率8.35%，饵料系数降低0.064；试验组2 与对照组相比，南美白对虾成活率提高2.00%，增长率提高0.06%，日增重提高0.669 kg/36 m3，区组间试验增重率8.26%，饵料系数降低0.057；试验组3 与对照组相比，南美白对虾成活率提高6.00%，增长率提高0.09%，日增重提高0.885 kg/36 m3，区组间试验增重率10.93%，饵料系数降低0.086；试验组4 与对照组相比，南美白对虾成活率提高8.00%，增长率提高0.12%，日增重提高1.138kg/36 m3，区组间试验增重率14.06%，饵料系数降低0.084。观察虾苗的活力、体力、体色和虾壳质量，4个试验组明显好于对照组。

经方差分析南美白对虾（养成期）30 天试验的平均重量结果：试验组1 与对照组比较：P=0.0171，0.01 ＜P ＜0.05，差异显著；试验组2与对照组比较：P=0.0183，0.01 ＜P ＜0.05，差异显著；试验组3与对照组比较：P=0.0007，P ＜0.01，差异极显著；试验组4 与对照组比较：P=0.0001，P ＜0.01，差异极显著；试验组1 与试验组2 比较：P=0.0057，P ＜0.01，差异极显著。

2.3 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾 工厂化淡水养殖中理化指标的影响

腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中理化指标影响见表9、表10。

由表9 可以看出，经过标苗期30 天的试验，结果表明：试验组与对照组相比，南美白对虾工厂化淡水养殖水质理化指标均有变化，pH 趋于稳定，透明度和浊度均在可控范围之内，氨态氮降低0.010 ～0.022 mg/L、亚硝酸盐降低0.012 ～0.022 mg/L。

经过养成期30天试验（表10），测定结果表明：试验组与对照组相比，南美白对虾工厂化淡水养殖中理化指标均有变化，pH 趋于稳定，透明度和浊度均在可控范围，氨态氮降低0.001～0.030 mg/L、亚硝酸盐降低0.016 ～0.026 mg/L。投放腐植酸饵料添加剂、微生物制剂的养殖池，应增加通气量，使溶解氧更加充分。

经方差分析南美白对虾（养成期）30 天试验的氨态氮结果：试验组1 与对照组比较：P=0.0463，0.01 ＜P ＜0.05，差异显著；试验组2与对照组比较：P=0.0474，0.01 ＜P ＜0.05，差异显著；试验组3 与对照组比较：P=0.0380，0.01 ＜P ＜0.05，差异显著；试验组4 与对照组比较：P=0.0205，0.01 ＜P ＜0.05，差异显著。

2.4 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中经济效益的分析

腐植酸饵料添加剂、微生物制剂对南美白对虾工厂化淡水养殖中经济效益的分析见表11。

由表11 可以看出，试验组1 投入成本增加172.8 元/36 立方米，增加收入810.8 元/36 立方米，增加产出638.0 元/36 立方米；试验组2 投入成本增加172.8 元/36 立方米，增加收入802.0 元/36 立方米，增加产出629.2 元/36 立方米；试验组3 投入成本增加345.6 元/36 立方米，增加收入1054.1元/36 立方米，增加产出708.5 元/36 立方米；试验组4 投入成本增加518.4 元/36 立方米，增加收入1365.6元/36立方米，增加产出847.2元/36立方米。

表7 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中中成活率与体色、虾壳质量的影响（养成期）Tab.7 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on survival rate, body color, shell quality of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the development stage)

表8 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中日增重与饵料系数的影响（养成期）Tab.8 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on daily weight gain and feed coefficient of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the development stage)

表9 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中水体理化指标的影响（标苗期）Tab.9 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on physical and chemical indicators of water body in P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the seedling stage)

表10 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中水体理化指标的影响（养成期）Tab.10 Effects of humic acid bait additives and microbial preparations on physical and chemical indicators of water body in P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture (the development stage)

表11 腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中的经济效益分析Tab.11 The analysis of humic acid bait additives and microbial preparations on economic benefit of P. vannamei in factory-based freshwater aquaculture

3 结论与讨论

（1）以单独使用腐植酸饵料添加剂，不同使用量腐植酸添加剂（0、5、10 mg/m3）和微生物制剂（枯草芽孢杆菌1 mg/m3、嗜酸乳杆菌1 mg/m3、海洋红酵母1 mg/m3、光合细菌2 mg/m3）配施为4 个试验组，以不使用腐植酸饵料添加剂和微生物制剂为对照组。经过标苗期30 天试验，结果表明：试验组与对照组相比，南美白对虾成活率提高3.50%～9.00%，增长率提高0.33%～1.00%，日增重提高0.125 ～0.190 kg/36 m3，区组间试验增重率5.68%～10.69%，饵料系数降低0.020 ～0.030。经过养成期30 天的试验，结果表明：试验组与对照组相比，南美白对虾成活率提高2.00%～8.00%，增长率提高0.06%～0.12%，日增重提高0.669 ～1.138 kg/36 m3，区组间试验增重率8.26%～14.06%，饵料系数降低0.057～0.086。

（2）腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中应用，可使养殖水体的pH 趋于稳定，氨态氮降低0.001 ～0.030 mg/L、亚硝酸盐降低0.016 ～0.026 mg/L，虾的体色和虾壳质量俱佳。经过标苗期30 天和养成期30 天的试验，养殖重量可达到285.97 kg/36 m3，成活率降低至88.0%，饵料系数达1.368。试验增加产出最多847.2 元/36 立方米，从经济效益分析，以腐植酸添加剂10 mg/m3和微生物制剂配施增加产出最佳。

（3）腐植酸饵料添加剂、微生物制剂在南美白对虾工厂化淡水养殖中应用，可以为南美白对虾的养殖提供小肽、氨基酸和蛋白质营养，可以降低养殖水体中的铵态氮、硝态氮、亚硝酸盐、硫化氢等有毒有害物质的浓度，有效地清除池底积累的残余饵料和排泄废弃物，促进单细胞微藻的生长，调节藻菌相，降低透明度，抑制光合作用，从而控制多细胞大型藻类的生长，结合枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶等复合酶系，可以起到控草作用，使养殖水体形成一个良性生态循环体系[11，12]。

综上所述，腐植酸饵料添加剂，作为绿色环保型生物饲料添加剂使用方便、无毒无负作用，在南美白对虾工厂化淡水养殖中的大面积应用潜力巨大，可在远离海岸线的内陆地区养殖，可利用蔬菜大棚、畜牧养殖大棚经过简单修整进行养殖，将腐植酸饵料添加剂与微生物制剂配合使用具有很好的环保效益和社会效益，应用前景广阔。

致谢：青岛理工大学2018 届硕士研究生乔凤禄提供水质分析数据，河南省新乡市长垣县鸿志农业与华大基因水产养殖基地余英华工程师提供部分养殖数据，在此一并表示感谢。