盐分胁迫下腐植酸对棉花幼苗生长和抗氧化系统的影响

于晓东 郭新送 范仲卿 宋 挚 丁方军 朱福军 苏秀荣，4⋆

1 农业部腐植酸类肥料重点实验室 泰安 271000

2 山东省腐植酸高效利用示范工程技术研究中心 泰安 271000

3 山东农大肥业科技有限公司 泰安 271000

4 山东农业大学化学与材料科学学院 泰安 271018

我国盐渍土的分布范围比较广，约为3.6×107hm2，占全国可利用土地面积的41.9%。少量盐分可促进作物对营养元素的吸收，促进作物生长，但当浓度过高时则对作物产生毒害作用[1，2]。滨海盐渍化土壤盐分含量一般超过0.2%（以全盐含量计算），达到轻度盐渍化及以上水平，对于棉花作物来讲，盐分含量超过0.4%就会严重制约生长。盐胁迫下，植物体内积累活性氧（ROS），导致细胞膜破环，但同时也会激活抗氧化酶的活性，以降低ROS 对细胞的氧化损伤[3，4]。研究表明，在盐胁迫环境的影响下，施用腐植酸可促进作物对营养元素的吸收，尤其对种子萌芽、幼苗生长以及根系具有积极作用[5，6]。彭正萍等[7]也指出，腐植酸类物质能对非生物胁迫表现出抗胁迫效应，促进盐渍环境下作物的生长。García A C等[8]在水稻上的研究表明，盐分胁迫下，腐植酸提高了抗氧化酶活性，加强了对氧自由基的清除，从而增强幼苗的抗氧化能力。另有研究表明，在盐碱土培育的盆栽大豆上喷施腐植酸，降低了大豆叶片丙二醛（MDA）含量，有效提高了大豆抗盐碱能力[9]。

本研究以滨海盐渍化潮土为供试土壤，进行棉花盆栽试验，对比不同腐植酸对棉花生长特性和抗氧化系统的影响，以期为腐植酸提高盐渍土棉花抗性的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤采自滨州沾化县冯家镇李家村（地理坐标为东经117°45′～118°21′，北纬37°34′～38°11′）0 ～40 cm 土层，土壤为滨海中度盐渍化潮土，基本理化性状如表1 所示。

表1 供试土壤基本理化性状Tab.1 Basic physical and chemical properties of tested soil

1.2 供试作物

棉花，品种为“苏杂6 号”，适宜盐碱土栽培。

1.3 供试材料

试验用常规肥料为棉花专用复合肥（N-P2O5-K2O=20-10-15）。腐植酸原料为风化煤腐植酸（未活化），产自新疆奇台，含水量19%，水溶性腐植酸质量分数（干基）1.5%，总腐植酸含量为56%，游离腐植酸含量为50%。以上材料均由山东农大肥业科技有限公司提供。

活化腐植酸的制备：称取风化煤100 g，置于液化反应釜中，加入500 mL 水，加浓盐酸10 mL，加热至沸，冷却至45 ℃以下，经过滤、洗脱，保留沉淀。再向反应釜中加入500 mL 水，并加入25 mL 氢氧化钠溶液（氢氧化钠浓度为20%），调至转速180 r/min，温度60 ℃，恒温加热60 min，冷却，静置分层。将反应釜中上清液取出，用1 ∶6 硫酸调节pH 至1.5 ～2，过滤后弃滤液，用去离子水洗涤滤渣至无SO42-为止。将滤渣烘干、粉碎即得活化腐植酸。

1.4 试验设计

试验于山东省泰安肥城市山东农大肥业科技有限公司蔬菜大棚内进行，共设置5 个处理，分别为常规施肥处理（CK），常规施肥+未活化腐植酸低量处理（T1），常规施肥+未活化腐植酸高量处理（T2），常规施肥+活化腐植酸处低量理（T3），常规施肥+活化腐植酸高量处理（T4），各处理详见表2。首先将花盆底部用纱网覆盖出水口并均匀铺满1 kg 细沙，再将称好的土和肥料倒在编织袋内，充分混合均匀，装入花盆中，每盆装土15 kg，所有的肥料均一次性基施。每个处理9 次重复，随机排列。棉花直接种播，待两片真叶后间苗定植，每盆留3 棵棉花幼苗，总共45 盆。定植后统一管理，分别在处理后25、35、45 天进 行破坏性采样，并进行指标测定。

表2 试验方案Tab.2 Experimental scheme kg/hm2

1.5 测定项目及数据处理

收获植株并将地上部和地下部分开，植株根系先用5 mmol/L CaCl2冲洗，再用蒸馏水冲洗干净，称鲜重；然后在110 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒重，测干重。光合色素含量的测定：用95%的乙醇研磨棉花叶片，25 mL 定容后，分别在665、649 和470 nm 下测定吸光值[10]；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：采用氮蓝四唑（NBT）法[11]；过氧化物酶（POD）活性测定：采用愈创木酚法[11]；过氧化氢酶（CAT）活性测定：采用紫外吸收法[12]；MDA 含量测定：采用硫代巴比妥酸法[13]；超氧阴离子（O2−·）产生速率测定：采用羟氨氧化法[14]。

采用Excel 2003 软件处理试验数据和绘表，采用DPS 7.05 软件对数据进行统计分析，采用最小显著极差法（LSD）进行差异显著性检验（P＜0.05）。

2 结果分析

2.1 腐植酸对棉花幼苗生长的影响

盐分胁迫下，不同处理的棉花幼苗长势差异显著（表3）。施用腐植酸的棉花株高、叶片叶绿素相对含量（SPAD 值）均显著高于常规施肥处理，活化腐植酸处理的棉花株高、SPAD 值显著高于未活化腐植酸处理。活化腐植酸低量与高量处理对棉花株高、SPAD 值无显著差异。未活化腐植酸低量与高量处理对株高无显著差异，但高量处理SPAD值显著高于低量处理。与对照相比，施用活性腐植酸能够显著增加茎粗，活性腐植酸高量处理下茎粗大于活性腐植酸低量处理，但差异不显著。未活化腐植酸处理25 天时，与常规施肥比，茎粗无显著差异，但高量处理茎粗最大；未活化腐植酸处理35 天和45 天时，与常规施肥比，茎粗差异显著，高量处理茎粗大于低量处理，但两者差异不显著。

表3 不同处理的棉花幼苗株高、茎粗和叶片SPADTab.3 Cotton seedling’s plant height, stem and leaf SPAD under different treatments

2.2 腐植酸对棉花幼苗生物量的影响

棉花幼苗生长45 天后，测得植株生物量如表4 所示。与常规施肥相比，未活化与活化腐植酸均显著提高了棉花幼苗地上部和地下部干、鲜重，且干、鲜重的变化趋势相同。未活化与活化腐植酸在高量处理下地上部干鲜重均显著高于低量处理，而地下部干鲜重在活化与未活化处理间差异不显著。腐植酸用量相同情况下，活化腐植酸处理的棉花地上部与地下部生物量均显著高于未活化腐植酸处理，低量处理下，活化腐植酸处理的棉花地上部和地下部鲜干重分别提高了50.50%、63.20%、5.10%和12.09%；高量处理下，活化腐植酸处理的棉花地上部和地下部鲜干重分别提高了17.76%、18.26%、7.28%和11.96%。表明活化腐植酸更有利于促进幼苗期棉花生物量的累积，进而为后期生殖生长提供充足的保障。

表4 不同处理的棉花幼苗生物量Tab.4 Cotton seedling’s biomass under different treatments 克/盆

2.3 腐植酸对棉花叶片内光合色素含量的影响

不同处理的棉花叶片内光合色素含量见表5，与常规施肥相比，施用未活化和活化腐植酸均显著提高了棉花叶片内叶绿素a 和叶绿素b 含量以及a/b，对类胡萝卜素含量的影响不显著。低量处理下，活化腐植酸较未活化腐植酸的绿素a 和叶绿素b 分别提高了5.37%、8.16%；高量处理下，活化腐植酸较未活化腐植酸的叶绿素a 和叶绿素b 分别提高了11.8%、14.01%，表明活化腐植酸对棉花叶片光合色素的提高能力优于未活化腐植酸。未活化腐植酸高量与低量处理间的叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量差异均不显著；活化腐植酸高量处理的叶绿素a 含量显著高于活化腐植酸低量处理，叶绿素b 和类胡萝卜素含量差异不显著。

表5 不同处理的棉花叶片内光合色素含量Tab.5 Content of photosynthetic pigment in cotton leaves under different treatments

2.4 腐植酸对棉花叶片和根系内抗氧化酶活性的 影响

不同处理对棉花叶片和根系内抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性影响差异较大（图1），各处理的叶片内SOD 和CAT 活性高于根系，而POD 活性与之恰恰相反。与常规施肥相比，施用未活化与活化腐植酸均显著提高了棉花叶片内SOD、CAT 和POD 活性；活化腐植酸低量与高量处理的棉花根系内SOD、CAT 和POD 活性均显著高于常规施肥处理，而未活化腐植酸低量处理的棉花根系内SOD、CAT 和POD 活性与常规施肥处理差异表现不显著。

图1 不同处理的棉花叶片和根系内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性Fig.1 Activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) in cotton leaves and roots under different treatments

未活化腐植酸与活化的腐植酸对棉花叶片和根系内抗氧化酶活性影响差异较大。与未活化腐植酸处理相比，活化腐植酸处理显著提高了棉花叶片和根系内SOD 活性，且活化腐植酸对根系SOD 活性的提高能力较叶片明显。低量处理下，活化腐植酸处理的棉花叶片和根系内SOD 活性较未活化腐植酸处理分别提高了3.41%和37.58%；高量处理下，活化腐植酸处理的棉花叶片和根系内SOD 活性分别提高了4.14% 和19.56%。未活化与活化腐植酸处理的棉花叶片和根系内POD 活性变化趋势与SOD 相似，低量处理下，活化腐植酸处理的棉花叶片和根系内POD 活性分别提高了44.43%和3.29%，而增加活化腐植酸用量的棉花叶片和根系内POD 活性有所下降，但差异不显著。未活化与活化腐植酸处理的棉花叶片CAT 活性无显著差异，而与未活化腐植相比，活化腐植酸显著提高了棉花根系内CAT 活性，提高幅度分别达到98.46%（腐植酸低用量）和63.96%（腐植酸高用量）。

2.5 腐植酸对棉花叶片和根系内过氧化物含量的影响

植物在生长过程中遭受逆境胁迫时体内代谢平衡发生紊乱，导致体内积累大量有害过氧化物质（MDA、·等），致使氧化还原平衡受损。盐分胁迫下，未活化与活化腐植酸均显著降低了棉花叶片和根系内MDA 含量和产生速率，但降低能力与腐植酸的种类和用量有关（图2）。低量处理下，未活化与活化腐植酸处理间的棉花叶片MDA 含量无显著差异，而高量处理下，活化腐植酸较未活化腐植酸棉花叶片MDA 含量降低了47.18%，差异显著。在棉花根系中，低用量的活化腐植酸处理，MDA 含量显著低于未活化腐植酸处理，降低幅度达到20.12%，而高用量的活化腐植酸与未活化腐植酸处理间无显著差异。

图2 不同处理的棉花叶片和根系内MDA 含量和产生速率Fig.2 Content of malondialdehyde (MDA) and superoxide anion production rate in cotton leaves and roots under different treatments

3 讨论

3.1 盐分胁迫下腐植酸对棉花生长特性的影响

在盐胁迫环境下，施用腐植酸可促进作物对营养元素的吸收，从而促进作物生长[5]。本试验研究表明，在盐分胁迫下，未活化与活化腐植酸均可显著提高棉花幼苗株高、茎粗、SPAD 值，提高棉花幼苗地上部和地下部干、鲜重。腐植酸用量相同情况下，活化腐植酸处理的棉花株高、茎粗、SPAD值及地上部与地下部生物量均显著高于未活化腐植酸处理，表明活化腐植酸更有利于促进幼苗期棉花生长发育，促进生物量的累积，进而为后期生殖生长提供充足的保障。腐植酸对植物生长的促进作用，来源于其对根系生长的刺激作用。这是由于腐植酸含有细胞激肽酶等有机生物激素，能够促进蛋白合成和细胞的生长[15～18]，从而促进根系生长，促进根系对养分的吸收，进而促进植物生长发育。

腐植酸可促进棉花叶片叶绿素的形成，并能防止叶片早衰[6]。通常，盐分胁迫下植物叶片叶绿素和类胡萝卜素含量下降，并随着胁迫时间的延长，叶片会失绿[19]。Marosz A[20]研究表明，盐分胁迫条件下，施用腐植酸能降低土壤介质的电导率，促进作物幼苗的生长，提高其叶绿素含量。本研究中施用未活化和活化腐植酸显著提高了棉花叶片叶绿素含量，而对类胡萝卜素含量的影响不显著。等用量腐植酸情况下，活化腐植酸较未活化腐植酸的叶绿素a 含量提高，高用量情况下差异显著，而低用量情况下，无显著差异；等用量腐植酸情况下，活化腐植酸较未活化腐植酸的叶绿素b 含量高，但无显著差异。表明活化腐植酸对棉花叶片光合色素的提高能力优于未活化腐植酸。高用量腐植酸对棉花叶片叶绿素b 和类胡萝卜素含量影响差异不大，说明腐植酸添加量并非越多越好，而是有一个适宜的浓度，这与Yigit F 等[21]的研究结果一致。

3.2 盐分胁迫下腐植酸对棉花抗氧化系统的影响

韩冰等[22]研究表明，盐胁迫下，叶片POD活性升高，CAT 和SOD 活性降低。腐植酸会通过刺激植物各器官中蛋白质和酶的合成，增强植物体内POD、CAT、SOD 等与活性氧代谢相关的酶活性[23]。本研究中，活化腐植酸处理的棉花叶片和根系内SOD 和POD 活性较未活化腐植酸处理有不同程度的提高；而活化与未活化腐植酸处理的棉花叶片CAT 活性无显著性差异，但活化腐植酸显著提高了棉花根系内CAT 活性，提高幅度达到63.96%～98.46%。这可能是腐植酸经过活化处理后小分子量组分增多，一些类似羧基、羰基、甲氧基等含氧官能团增多，这些小分子量组分是腐植酸中最具活性的部分，更容易被植物所吸收。郭伟等[24]研究指出腐植酸可降低植物体内MAD含量，调节植物体内的活性氧含量，本研究中未活化与活化腐植酸均显著降低了棉花叶片和根系内MDA 含量和产生速率，与前人研究结果一致。这说明腐植酸可以通过提高棉花体内抗氧化酶的活性来促进过氧化物的分解，降低植物体内过氧化物的累积量，减轻膜质氧化损伤，最终提高植物抗逆境胁迫能力。

4 结论

（1）盐分胁迫下，施用腐植酸显著提高了棉花幼苗的生物量，且活化腐植酸更有利于促进幼苗期棉花生物量累积，较未活化腐植酸处理的棉花生物量提高了7.28%～63.20%。

（2）盐分胁迫下，施用腐植酸显著提高了棉花叶片叶绿素含量，活化腐植酸对棉花叶片光合色素的提高能力优于未活化腐植酸，等腐植酸用量的情况下，活化腐植酸较未活化腐植酸处理，棉花叶片叶绿素含量提高了5.37%～14.01%。

（3）盐分胁迫下，施用腐植酸可通过提高棉花体内抗氧化酶的活性来促进过氧化物的分解，降低植物体内过氧化物的累积量，从而提高棉花对盐分的抗逆能力，其中活化腐植酸对提高棉花抗盐胁迫的效果优于未活化腐植酸。