聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的应用进展

贺晶晶 高俊珍

内蒙古医科大学附属医院呼吸内科,呼和浩特010000

肺癌是目前我国发生率增长最快的恶性肿瘤,短短30年,肺癌由我国癌症死因回顾调查第5位跃居首位,是当今威胁人类健康的最严重的肿瘤之一。据相关研究统计,大约75%～80%的患者在诊断明确时已发展为晚期肺癌[1-2],失去手术治疗机会,而化疗在晚期肺癌的治疗占有不可替代的地位。恶性肿瘤化疗后骨髓抑制发生率高达50%～91.3%,Ⅲ、Ⅳ度骨髓抑制相关性死亡率最高达12%。其中粒细胞减少症是化疗最严重的血液学毒性反应,90年代以前化疗引起的粒细胞减少症主要靠输血及口服一些升白细胞的中西药,如：利可君、鲨肝醇、地榆升白片、维生素B4等,但疗效不佳；所以重组人粒细胞集落刺激因子 (recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)应运而生,1991年上市成为首个可治疗粒细胞减少的药物,但其半衰期短、需反复注射,后根据市场需求研制出可用于预防粒细胞减少的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子 (pegylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,PEG-rhG-CSF)。本文主要对PEG-rhG-CSF合成、作用机制及临床应用进行介绍。

1 粒细胞集落刺激因子 (granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)的发现及作用机制

人体内本身存在内源性G-CSF,它是一种大小为19 600的酸性糖蛋白,由人体的巨噬细胞、纤维母细胞和内皮细胞分泌产生[3]。G-CSF属于Ⅱ类造血生长因子,有细胞系特异性,无种族特异性,仅作用于中性粒细胞及其祖细胞[4]。而且是控制髓系祖细胞增殖和分化为中性粒细胞的主要生长因子[5]。科学家们从基础到临床,从动物到人类,历经50余年才得以让世人揭开它的神秘面纱,后来应用重组技术批量生产,为人类解决了恶性肿瘤化疗后粒细胞减少的大问题。

1935年Pluzniek和Sachs[6]报道,在琼质培养基上进行小鼠骨髓干细胞培养时,底层放入肾细胞和胎儿细胞,可见到粒细胞集落和巨噬细胞集落的形成。由此推测,底层细胞可能分泌一种特异的活性物质,刺激粒细胞和巨噬细胞集落的形成。1966年Ichikawa等[7]分别在小鼠骨髓细胞和脾细胞集落培养过程中发现,粒细胞、巨噬细胞只有在含有 “滋养”细胞或组织的条件培养基中才能分裂、增殖,形成集落。依照促红细胞生长素的模式,他们推测在条件培养基中含有一种刺激粒-巨噬系细胞增殖的调节因子,并首次提出 “集落刺激因子”的概念。

1977年Stanley和Heard[8]从小鼠纤维母细胞培养液中分离到功能相似的集落刺激因子。至1983年,各实验小组通过分离、纯化,得到4种鼠类集落刺激因子,即G-CSF、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞细胞集落刺激因子和IL-3。在鉴定鼠G-CSF后,发现了具有类似活性的人类分子,通过研究其受体结合以及生物学作用,发现这种人类分子,与先前在人胎盘条件培养基中鉴定的具有造血活性的刺激因子相同[9]。鼠和人G-CSF分子的增殖和分化诱导活性与物种边界交叉,后者以物种特异性方式对嗜中性粒细胞谱系具有活性。

1975年Stanley等[10]首次成功地从人尿中分离到一种刺激巨噬细胞集落形成的集落刺激因子。Welte等[11]于1985年成功地从人膀胱癌细胞系5637的低血清 (0.2%胎牛血清)-条件培养液中纯化精制出多能造血集落刺激因子。集落刺激因子是由多种组织和肿瘤细胞系产生的调节造血的激素样糖蛋白,该蛋白也能够刺激混合菌落祖细胞(粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞的集落形成单位)以及早期红系祖细胞的体外生长[11-12],经过进一步的研究,推定多系刺激活性是一种间接作用,被纯化的天然多能性分子主要活性是体外诱导中性粒细胞集落的形成[13]。

1986年Nomura等[14]建立了一种人类鳞状癌细胞系,称之为CHU-2,可产生大量的集落刺激因子,并且成功地从这些细胞的无血清条件培养液中纯化了对人和小鼠骨髓细胞都有效的粒细胞系特异性集落刺激因子。该研究最后纯化出的集落刺激因子是一种具有人类活性的粒细胞谱特异性集落刺激因子,并且报道了该人G-CSF 的生化特性,包括一个独特的NH2末端氨基酸序列。同年Nagata等[15]利用Nomura纯化的G-CSF的部分氨基酸序列衍生的寡核苷酸探针克隆编码了人G-CSF 的cDNA。他们证明了在细胞培养中,该cDNA 被转录成具有生物活性的人G-CSF,证实了该因子的纯化源于人类集落刺激因子产生细胞系(CHU-2),该细胞系在无血清条件培养基中可产生大量集落刺激因子活性。

大量体外实验表明,集落刺激因子主要从以下4个方面作用于造血细胞：(1)维持祖细胞和成熟血细胞在体外的存活；(2)促使非增殖期细胞进入增殖期,刺激造血细胞增殖。一般在极低浓度下即能发挥作用,其浓度不仅决定了细胞周期的长短,也决定了增殖细胞的数量；(3)诱导造血细胞的分化和成熟。该作用是部分的、有限的,仅表现在粒-巨双向潜能祖细胞,在巨噬细胞集落刺激因子或G-CSF存在条件下能以不可逆的优势形成巨噬细胞或粒细胞集落； (4)增强成熟粒细胞和单核、巨噬细胞的生物活性[16]。

G-CSF能促使粒系祖细胞的分化、增殖和成熟；促进骨髓中的造血干细胞和成熟中性粒细胞释放到外周血中[4]；可增加活性氧的生成,增强粒细胞的杀菌能力、吞噬能力以及抗体依赖性细胞杀伤力[17]；可明显加速粒细胞的恢复,缩短粒细胞缺乏的时间,减轻中性粒细胞减少的程度,降低感染的发病率。

2 rhG-CSF的生产及应用

为了批量生产应用于临床,保证体外药物的稳定性,1986年Souza等[18]报道人G-CSF 基因在大肠杆菌中重组成功,表达并制备出重组蛋白。它是通过将人体G-CSF基因插入大肠杆菌的DNA 后,由大肠杆菌表达产生的一种含175个氨基酸的蛋白质,有刺激粒细胞集落形成的作用。人内源性G-CSF含有糖基,在大肠杆菌中表达的G-CSF无糖基,因糖基对G-CSF的生物学活性没有明显贡献,所以其功能与内源G-CSF无明显差异[19-20]。

rhG-CSF与天然G-CSF功能相似,它与粒细胞表面特异性的受体结合,特异性刺激中性粒系祖细胞的分化和增殖,同时也增强了中性粒细胞的趋化作用,增加了过氧化物的产生[21]。国外2项动物实验[22-23]表明：rhG-CSF在体内引起的造血增生作用与体外实验结果相似。每日注射1～3次rhG-CSF,通常可致外周血和组织中粒细胞、巨噬细胞数量增高10～100倍,且随着反复注射而得以维持。

rhG-CSF在接受小细胞肺癌强化化疗的患者中的Ⅰ/Ⅱ期临床研究开始于1987年[24],重组人G-CSF 体现出良好的耐受性,明显减少因强化化疗方案引起的粒细胞减少症和重症感染。起初研究发现应用rhG-CSF 后,中性粒细胞计数先迅速出现短暂的减少,之后很快则呈剂量依赖性的持续升高。Ⅲ期临床试验证实,预防性应用rhG-CSF 与安慰剂相比,可以使中性粒细胞减少性发热 (febrile neutropenia,FN)的发生率、感染的发生率下降约50%,Ⅳ度中性粒细胞减少的发生率从89%降低至56%,平均持续时间减半,静脉应用抗生素治疗时间与住院日分别缩短47%和45%[25]。

非格司亭 (Neupogen TM)在1991年作为第一个rhGCSF被美国食品药品监督管理局批准上市,之后被70多个国家批准用于治疗骨髓移植后的骨髓抑制、严重的慢性中性粒细胞减少症、急性白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征以及动员外周血祖细胞进行移植。非格司亭的使用使全剂量化疗和大剂量化疗成为可能,并使免疫受损的患者受益。第二种形式的非格司亭,名为来格司亭(GranocyteTM),由中华仓鼠卵巢细胞表达产生的一种含174个氨基酸序列的rhG-CSF,1993年在欧洲被批准临床应用；研究表明非格司亭与来格司亭的生化特性相近,来格司亭具有糖基化,这是两者的主要区别[26]。1993年中国药政主管部门先后批准日本生产的非格司亭和来格司亭上市,主要用于治疗和预防肿瘤化疗后引起的中性粒细胞减少症[27-28]。

紧随其后,我国开始自主研制rhG-CSF,我国食品药品监督管理局最终在1996 年批准了我国第一个rhG-CSF(商品名：吉粒芬)上市,由杭州九源基因工程有限公司生产,历经20多年应用发展,到目前为止,临床上应用的国产rhG-CSF有13种。

继1991年之后,rhG-CSF 被广泛、迅速应用于临床。国内外多项基于循证医学的荟萃分析结果表明,使用rhGCSF后Ⅳ度粒细胞减少的持续时间、患者的住院时长明显缩短[29],与FN 相关不良事件发生减少以及感染相关死亡率的明显降低[26,30]。随后很快被写入美国、欧洲、加拿大等国家权威学术机构的指南,2011年欧洲癌症研究与治疗组织 (European Organisation for Research and Treatment of Cancer,EORTC)推荐：65岁以上老年人,原发肿瘤控制不佳,存在超过10 d的中性粒细胞减少 [绝对中性粒细胞计数 (absolute neutrophil count,ANC)＜0.1×109/L],败血症,肺炎,侵袭性真菌感染以及发热后需要住院的患者等不良预后因素,推荐应用非格司亭治疗[31]。

rhG-CSF在临床上主要通过刺激造血细胞增殖,提高外周血细胞数,纠正骨髓抑制状态；通过提高外周粒细胞数量,加强成熟粒细胞功能,增强机体抵御感染的能力[32]。一项回顾性研究发现,肿瘤患者化疗后预防使用rhG-CSF可以使FN 的风险下降50%,而不影响肿瘤化疗疗效和患者的总生存率[33]。rh G-CSF的问世给临床带来了极大的帮助,为化疗后粒细胞减少的患者解决了难题,具有极其长远、广袤的应用前景。

3 PEG-rhG-CSF的合成与机制

尽管rhG-CSF为临床工作解决了难题,为患者减轻化疗后骨髓抑制的痛苦,但是每个化疗周期rh G-CSF需多次给药,在临床具体实践中常常难以实现,临床切实应用时,rhG-CSF的使用天数会更短,而国外一项研究也证实了rhG-CSF用药时间过短会对治疗、预防效果有一定影响[34]。为了达到化疗按时进行、减少用药次数、减轻患者负担等临床迫切需求,所以血浆半衰期延长、可 “自身调节”、体内活性增强的PEG-rhG-CSF应时而生。

PEG-rhG-CSF是将rhG-CSF 进行N 末端聚乙二醇化学修饰而得。PEG 是一种水溶性多聚体,中性且无毒,有良好的生物相容性,没有明显生物活性,所以PEG-rhGCSF的作用机制与rhG-CSF大致相同。聚乙二醇修饰又称为分子的聚乙二醇化,是20世纪70年代后期发展起来的一项前景技术,将具有活性的聚乙二醇与短效的药物进行偶联,药物分子的空间结构被影响,生化性质被改变,从而使药物达到半衰期增加,水溶性增加,免疫原性降低,改善药效性质和药代动力学,扩展临床应用范围的效果[35]。聚乙二醇修饰可以遮蔽rhG-CSF 表面的抗原决定簇,使其不被免疫系统识别清除,所以其抗原性和免疫原性降低,不易产生中和性抗体[36-37]。同时经聚乙二醇修饰后rhG-CSF的相对分子量大大提高,不易被肾小球滤过,体内半衰期显著延长。因此,中性粒细胞介导的清除机制占据主导地位,PEG-rhG-CSF的清除率取决于中性粒细胞计数,当化疗后中性粒细胞减少时,中性粒细胞介导机制清除减缓,当中性粒细胞计数回升时,该机制药物清除加快,正因PEG-rhG-CSF 这种血药浓度的 “自我调节”作用,使其临床应用安全性显著提高。PEG-rhG-CSF 在药效学及FN 相关不良事件方面与rhG-CSF相比大致相仿甚至更好[31]。

临床前研究的动物模型中的药代动力学研究表明PEGrhG-CSF比rhG-CSF 具有更长的半衰期 (7.1 h 比1.8 h)和更持久的作用时间 (168 h比48 h)。在给予rh G-CSF和给予PEG-rhG-CSF的大鼠中,达到ANC峰值时间 (12 h)相同。此外,PEG-rhG-CSF的清除率比非格司亭的清除率低8.6倍[38]。PEG-rhG-CSF在啮齿动物和非人类灵长类动物中的临床试验表明,单次剂量后PEG-rhG-CSF的血清浓度可持续,其中性粒细胞反应与PEG-rhG-CSF血清浓度密切相关[39]。国外有研究单次或双次施用PEG-rh G-CSF 以显著改善严重放射性骨髓抑制的恒河猴模型中的中性粒细胞恢复的能力,在中性粒细胞减少动物中,直到造血恢复开始后,均可维持有效的PEG-rhG-CSF血浆浓度,这与依赖中性粒细胞消除的特性一致[40]。

我国进行的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床研究相继讨论了PEGrhG-CSF的有效性及安全性。石远凯等[41]教授开展的Ⅰ期临床耐受性试验首次报道了我国临床应用PEG-rh G-CSF的安全性,剂量爬坡后推荐Ⅱ期临床试验的剂量为100 mg/kg,但未能确定受试药的剂量限制性毒性及最大耐受剂量。由徐兵河教授牵头的Ⅱ期临床试验[42]和Ⅲ期临床试验[43]表明PEG-rhG-CSF 与rhG-CSF 比较,预防化疗引起中性粒细胞减少的疗效确切,不良反应发生率低,更具优势。国外也有研究表明早期预防性应用PEG-rhG-CSF可使中性粒细胞减少的发生率降低94%,静脉抗感染药物的使用减少80%,并降低住院率[36]。

PEG-rhG-CSF是安全性较高的药物,在其Ⅰ期临床试验研究中,未发现剂量限制性毒性[41,44]。应用PEG-rhGCSF后约有25%的患者会出现轻至中度骨痛,这是PEGrhG-CSF较为常见的不良反应,与常规应用rhG-CSF 后骨痛发生率 (26%)相当。一般而言骨痛大多出现在化疗后1周,持续时间通常为2～3 d,轻到中度骨痛,大部分患者可自行缓解,部分患者给予非甾体类药物后症状可逐渐缓解。

使用PEG-rh G-CSF可以使化疗后ANC 最低值提高并使其出现时间前移；用药后观察ANC 曲线呈双峰形,第1峰是PEG-rh G-CSF促进骨髓中成熟的粒细胞向外周血所致,第2峰是PEG-rh G-CSF刺激骨髓粒系造血祖细胞加速增殖、分化、成熟和释放的结果[45]。而且使用PEG-rhGCSF预防用药组的ANC 最低点的平均值均高于未使用rhG-CSF的对照组[41]。

国外目前常用的PEG-rhG-CSF 是美国Amgen公司研发生产的聚乙二醇化重组甲硫氨酰人粒细胞集落刺激因子,培非格司亭 (NeulastaTM)是第一个用于临床的PEGrhG-CSF,已于2002年2月获美国食品药品监督管理局批准上市。我国首个仿制的国产PEG-rh G-CSF商品名为津优力,国家食品药品监督管理局在2012 年3 月正式批准上市。

多个Ⅱ期和Ⅲ期研究证实,培非格司亭允许按时交付完整的化疗剂量,并允许在乳腺癌和NHL 患者中进行剂量密集化疗[46-48]。这种益处也延伸到老年患者,Balducci等[49]结果显示,从第一个周期预防性培非格司亭6 mg可促进65岁以上患者接受全剂量化疗治疗肺癌、乳腺癌或卵巢癌或非霍奇金淋巴瘤。Kuderer等[50]进行的系统回顾和meta分析更明确地证明,接受G-CSF (非格司亭、来格司亭或培非格司亭)预防性治疗的患者,在细胞毒性化疗方面的药物剂量减少和延迟治疗明显少于那些接受安慰剂或不支持治疗的患者。

国外一项研究总结分析了17 项G-CSF 预防使用的随机试验 (包含3 493例成人实体瘤和淋巴瘤患者),得出化疗后一级预防应用PEC-rhG-CSF 可显著降低92.3%的FN发生风险 (P＜0.001)[50]。Vogel等[51]研究表明,接受PFG-rhG-CSF一级预防患者的FN 发生率由17%下降至1%,抗感染药物使用率和住院发生率分别下降8%和13%。美国的一项观察性研究显示,使用PEG-rhG-CSF预防与接受常规rh G-CSF 预防相比,FN 的相对风险增加41%；而所有使用PEG-rhG-CSF的患者均完成每周期全剂量用药[52]。

PEG-rhG-CSF经过多项研究证实,已被广泛应用于临床,最早于2006 年被写进美国临床肿瘤学会指南[53]；后逐渐进入美国国立综合癌症网络[54]以及EORTC[31]等多部权威指南。3大指南一致建议FN 高风险的化疗方案 (FN风险分级：＞20%为高度；≥10%且≤20%为中度；＜10%为低度)推荐一级预防性应用G-CSF。若患者存在以下危险因素时,即使FN 为中度风险,也可考虑一级预防性使用G-CSF：高龄 (＞65 岁)、体能评分差、营养状况差、既往发生过FN、恶性肿瘤进展、前期高强度治疗、同步放化疗、肿瘤侵犯骨髓引起血细胞减少、有开放性伤口以及其他严重并发症等。G-CSF的二级预防是指前一个化疗周期未一级预防应用G-CSF,但发生了粒细胞减少症,而在本次化疗时,因考虑到治疗效果、无病生存时间或总生存时间而不能减少化疗剂量,所以预防性给予G-CSF。

我国于2016年首次将PEG-rhG-CSF 写入指南,逐渐修订完善,2017年肿瘤放化疗相关中性粒细胞减少症规范化管理指南推荐：对于接受FN 风险＞20%化疗方案的患者,无论治疗目的是改善疾病相关症状、延长生存时间或是治愈,都建议进行一级预防性使用G-CSF[45]。若患者在接受中危FN 风险 (10%～20%)化疗方案治疗时满足任何一条高危因素 (与美国临床肿瘤学会、美国国立综合癌症网络、EORTC指南所指定高危因素一致),则应考虑进行G-CSF的一级预防。第2次或后续化疗周期对既往化疗进行评估,如果患者发生过FN 或剂量限制中性粒细胞减少事件,则推荐进行G-CSF的二级预防。

4 国内外指南执行现状

目前PEG-rh G-CSF临床应用时间短,国内指南出现较晚。在一项全国性调研结果中,研究者共对31家医院发放250份问卷,调研结果发现目前国内临床肿瘤学医师不规范使用G-CSF的比例较高,依照指南规范应用G-CSF 仅49.7%[55]。而且也有研究指出,目前临床上我国临床应用短效rhG-CSF存在延迟用药和提前停药的情况,患者依从性较差[34]。国外大量研究和meta分析表明,G-CSF 预防应用可以使FN 的发病率、感染相关死亡率和全因死亡率显著降低[33,50,56],指南推荐应用与临床实际应用还是有区别,总体上讲,国外临床应用G-CSF较国内规范。

5 PEG-rhG-CSF应用展望

在医疗条件的改善和化疗药物不停进步的总体环境下,患者对化疗期间生活质量的要求逐渐增高。首先,PEGrhG-CSF是对rhG-CSF 进行了化学修饰、化学变构,使PEG-rh G-CSF拥有了比rhG-CSF更为优异的药代动力学和临床药效学,临床疗效也更好。其次,在之后的临床实践中需要对PEG-rhG-CSF应用剂量做更深一步的探索,实现个体化治疗,必要时与短效制剂相结合。最后,要对PEGrhG-CSF应用领域进行探索,除化疗引起粒细胞减少之外,还有重症感染；血液系统疾病：再生障碍性贫血、骨髓异常综合征、淋巴瘤骨髓侵犯等；药物损害,如抗生素：美罗培南、多西环素、磺胺类等；抗结核药物：异烟肼、利福平；免疫抑制剂：硫唑嘌呤、环磷酰胺、甲氨喋呤等；解热镇痛药等,为今后临床研究及应用提供更多参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突