口腔黏膜癌变过程中血清生化标志物的研究进展

董云梅 陶艳 周瑜

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院口腔黏膜病科 成都 610041

口腔黏膜癌变是指口腔黏膜从正常状态经口腔潜在恶性疾患（oral potentially malignant disorder，OPMD）阶段发展为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），直至远处转移的多步骤、多阶段、多基因改变的过程。OPMD包括口腔白斑病（oral leukoplakia，OLK）、口腔红斑病（oral erythroplakia，OEK）、口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）、口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）等。口腔癌在全球最常见的癌症中排名第六位，其中OSCC占92%～95%，其发病率在世界范围内呈增高趋势，且大多数OSCC均由OPMD转化发展而来[1]。OPMD的主要治疗方法有药物治疗、手术治疗、冷冻及光动力治疗等，OSCC主要采取以手术治疗为主并结合其他治疗（如放射治疗、化学治疗）的综合治疗。

组织病理学检查仍是口腔黏膜癌变各阶段疾病诊断金标准，但由于具有有创性、耗时长、操作复杂等特点，目前，大量的OPMD和早期OSCC的无创筛查方法，如细胞刷技术、荧光法、生物染料染色法、液体活检等[2-3]应运而生，在口腔黏膜癌变的早期诊断、个性化治疗、治疗预后和随访监测等方面发挥了巨大作用。近年来研究发现，血清中多种生化标志物的改变可发生在癌变早期，通过对其监测可辅助早期诊断。本文将对口腔癌变过程相关的血清生物化学物质的研究现状作一综述。

1 血清蛋白

1.1 β2微量球蛋白

β2微量球蛋白是一种存在于除红细胞外的所有细胞表面的低分子蛋白，尤其是淋巴细胞和肿瘤细胞，而在人尿液、血浆及脑脊液中也可少量出现。它的编码基因位于人第十五号染色体上，因其蛋白相对分子质量较小（相对分子质量为11 700），电泳显带于β2区所得名。

1968年，有学者首先描述了该种蛋白，并从肾小管蛋白尿患者的小便中将其分离出来。该蛋白质是人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的轻链或β链，以游离或者共价形式与HLA抗原相连，构成了HLA分子中的不可变部分。血清中的β2微量球蛋白以游离的形式存在，它由具有一个链内二硫键的单链多肽链组成，不含碳水化合物。正常人β2微量球蛋白的合成率及从细胞膜上的释放量相对恒定，β2微量球蛋白可以从肾小球自由滤过，但近99.9%的β2微量球蛋白在近端肾小管又被重吸收，故正常情况下血清β2微量球蛋白保持稳定水平。

目前研究认为，β2微量球蛋白是一种非特异性恶性生化标志物。1981年Scully[4]第一次研究了口腔癌患者血清β2微球蛋白的表达，发现与健康人群相比，口腔癌患者的血清β2微球蛋白水平明显升高。Singh等[5]对16例正常人、8例OSF、8例OLK、16例OSCC的血清β2微量球蛋白进行研究，其平均浓度分别为：（1.173±0.059）、（1.710±0.139）、（1.688±0.140）、（2.835±0.031） mg·L-1，敏感度为100.00%，特异度为99.94%。在先前Kadam等[6]对OSCC患者的血清β2微量球蛋白研究中，其敏感度和特异度均为100.00%，且血清β2微量球蛋白含量与肿瘤的大小、分期及是否发生淋巴结转移均有一定的相关性。多项研究[7-8]均表明，口腔癌、OLK患者中血清β2微量球蛋白升高的原因主要有以下2个方面：一是癌细胞的活性增加，其β2微量球蛋白的合成能力也随之增加；二是癌细胞裂解增加，β2微量球蛋白的释放增多，抑或二者兼而有之。有研究[9-11]表明，口腔癌恶性程度和OLK异常增生程度越高，其相对应的血清β2微量球蛋白水平也越高；血清β2微量球蛋白水平的上升与细胞活性和肿瘤负担的增加有着密切的关联。升高的血清β2微量球蛋白与细胞异型性程度相关，这提示β2微量球蛋白水平可作为评估OPMD恶变潜能的生物学标志物。值得注意的是，除OPMD以及口腔癌之外，在各种晚期恶性肿瘤患者、肾脏疾病、获得性免疫缺陷综合征、牛皮癣、非霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、乳腺癌、结肠癌、胃癌、子宫颈癌等中，也观察到了血清β2微球蛋白水平的升高[4,12-13]。因此，在将β2微球蛋白作为OPMD恶变潜能的标志物进行评价时，应排除上述疾病的干扰。

1.2 细胞角蛋白19片段抗原

细胞角蛋白19片段抗原（CYFRA21-1）是细胞角蛋白19的可溶性片段，是一种公认的生化标志物，在非小细胞肺癌，尤其是鳞状细胞癌（独立预后因子）中具有较高的敏感性和特异性[14]。在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量细胞角蛋白片段释放入血，其可溶性片段可与2株单克隆抗体（KS19.1和BM19.21）特异性结合，故称为CYFRA21-1。研究者[15-16]首次证实了OSCC患者中血清CYFRA21-1水平与健康对照组相比明显升高。后续相关研究也相继表明，血清CYFRA21-1具有较高的灵敏度和特异性。但有学者[17-18]的研究表明，在OSCC患者血清中，CYFRA21-1水平变化的灵敏度和特异性较低。

2 循环免疫复合物

循环免疫复合物（circulating immune complex，CIC）是指在体液中游离的抗原-抗体复合物，通常情况下，血循环中大分子CIC迅速被单核-巨噬细胞系统清除，小分子CIC在血循环中难以沉积，通过肾脏时被排出体外。但是在一些特殊情况下，免疫复合物仍然可持续存在于血液循环中[19]。当它们在器官中沉积时可能导致疾病的发生，例如血管炎。免疫复合物沉积是一些自身免疫疾病的突出特征，包括系统性红斑狼疮、冷球蛋白血症、类风湿性关节炎、硬皮病和干燥综合征。CIC水平与癌症进展之间存在强相关性，其扮演了组织损伤机制的始动者的特定角色[20]。

头颈部癌症患者的免疫异常情况比与支气管、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌或膀胱癌相关的癌症患者更为严重[21]，且CIC可在75%的头颈部癌患者中被检测到[22]。Maheswari等[23]和Scully等[24]发现了与健康患者相比，OLK、OSF患者及口腔癌患者CIC水平明显升高。OPMD及口腔癌的恶性程度可以通过血清中存在的CIC水平进行评估，并且可以与组织病理学研究相关联以实现适当的分级。Tiwari等[25]对30例正常人、40例OPMD、40例OSCC的CIC进行研究，用3.75%聚乙二醇血清沉淀法在酶标仪吸收波长为470 nm的条件下测得其平均吸光度值依次为0.048±0.02、0.18±0.21、9.65±0.16。Wang等[26]研究发现，胸腺肽α1蛋白（thymosin α1 protein，PTMA）在OSF过程中是一种必需的自身抗原，具有调节口腔黏膜下成纤维细胞的增殖和细胞外基质的作用，血清PTMA水平与对照组相比明显升高，靶向PTMA可能是治疗OSF的一种很有前景的策略。

当研究的样本量足够大时，若能从血清中鉴定并分离出与口腔黏膜癌变相关的特异性抗原，则将有助于口腔鳞状细胞癌的早期发现和治疗。

3 血清矿物质

矿物质是构成人体组织和维持正常生理功能必需的各种元素的总称，是人体必需的七大营养素之一，分为常量元素和微量元素。常量元素是指占人体比重超过0.01%的元素，包括钙、钠、磷、钾和镁等；微量元素是指含量低于人体总量的0.01%，且每日摄入量低于100 mg的元素，主要包括铜、钴、铬和氟等。矿物质所参与构成的酶在某些生物和化学反应中起着重要的作用，它们与蛋白质和其他辅酶协调工作，吸引底物分子并使其转化成为特定的终产物。

一些关于饮食和癌症相关性的研究表明，一些元素特别是硒、铜、锌、镁和铁等矿物质在癌症的发生和发展中有着重要的作用。许多元素在维护细胞生长和增殖方面是不可或缺的，一些元素含量过低或过高均可能造成细胞乃至人体生理功能的损害。许多代谢紊乱疾病、OPMD和口腔癌等患者均伴随着体内一种或多种矿物质元素如镁、铜、铁等浓度的改变，在血清或血浆中，这种变化更为明显。

3.1 血清铜

铜离子在生物损伤中的作用是由超氧化物自由基或其他还原剂（例如抗坏血酸盐）引起的，其作用是减少铜络合物。当这些铜络合物水平升高时，与过氧化氢反应形成羟基自由基、造成蛋白质、RNA和DNA的损伤，从而引发癌变过程。Jayadeep等[27]和Khanna等[28]的研究也表明，正常人、OPMD患者、口腔癌患者的血清铜水平逐渐升高，且差异有统计学意义。血清铜水平的升高伴随着血清铜蓝蛋白水平的升高。Shah等[29]的研究表明，与健康对照组相比，OSCC、OSF、OLK组血清铜蓝蛋白水平显著增加（P＜0.001），在疾病组的组内分析中，差异无统计学意义（P＞0.05）。Hosthor等[30]对30例正常人、30例OSF、30例OSCC患者血清铜、铁、镁、锌、钙水平进行研究，结果显示，除血清铜水平在正常人、OSF、OSCC患者中逐渐上升外，其余4种矿物质均呈下降趋势；该作者认为，咀嚼槟榔习惯与这2种疾病状态相关，并可能在改变这些微量元素的血清水平中起了一定的作用。

3.2 血清铁

铁是机体必需的微量元素，有着广泛的生物学作用，包括氧化运输和细胞呼吸作用，缺铁会引起细胞生长停滞或死亡，铁过载会使细胞发生氧化应激损伤细胞膜、蛋白质、核酸。Ramanathan[31]报道，缺铁可能是OSF的促进因素之一，在胶原合成中铁通过羟基化脯氨酸和赖氨酸导致了OSF患者血清铁水平的降低。Khanna等[28]的研究表明，与正常人相比，OPMD及口腔癌患者血清铁水平均有不同程度的下降，且口腔癌患者中下降水平更为明显。

3.3 血清镁

镁是活细胞中存在的最丰富的阳离子之一，它是多种生理功能所需的必需元素，血清镁浓度在健康人群中比较稳定。镁具有各种各样的生物学功能，包括络合带负电荷的基团，如核酸中的磷酸盐，在酶活化或抑制中的控制作用以及通过调节细胞增殖，细胞周期进程和分化的调节作用等。在Aziz等[32]的一项研究中，研究对象分为3组，分别为正常人组、OPMD组、口腔癌组，每组共纳入17名受试者，二甲苯胺蓝法测得其平均血清镁浓度依次为1.918、1.695、0.732 mmol·L-1，三组间两两比较P值均小于0.001，这表明，在口腔黏膜癌变过程中，血清镁的水平呈下降趋势。

除以上3种矿物质元素外，血清锌、硒、钙、镉、铬等水平与口腔癌变过程存在一定的关联，但具体机制不明，需进一步研究阐明。血清中矿物质浓度的变化可作为口腔恶变发生的早期提示，其浓度变化的大小可在一定程度上反应恶性进展的程度。

4 血清糖缀合物

4.1 唾液酸

唾液酸是一系列含9个碳原子羟基化单糖酰化衍生物的统称，是糖复合物结构和功能多样化的重要物质基础，通常位于糖蛋白和糖脂的糖基化非还原末端[33]。其在体内的主要存在形式为位于细胞膜糖蛋白以及糖脂寡糖链末端残基端的唾液酸和血中游离型唾液酸3种，是细胞膜的一种重要组成成分，它也存在于血液、血浆、母乳、胆囊排泄物、滑液、汗液、胃液和尿液等体液中。正常代谢时，血清中唾液酸含量非常稳定，当正常细胞受损或者发生恶变时，细胞膜上糖脂合成会增加且转化异常，从而使其更多地脱落进入血液中，导致肿瘤患者血清唾液酸水平升高。已有文献报道发现，血清唾液酸水平与肿瘤的发生、发展、转移等密切相关，血清唾液酸的表达变化在肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌的诊断中均有一定的价值。多项关于OPMD和口腔癌的研究[34-38]发现，在健康个体、OPMD患者、口腔癌患者血清中，无论是总唾液酸还是游离唾液酸，其表达水平均明显升高，且与疾病的病理级别呈正相关。

4.2 L-岩藻糖

L-岩藻糖是一种甲基戊糖，是细胞膜、细胞被膜中糖链的一种，脱落后在血液中常与某种血清蛋白以结合的形式存在，正常人血清中含量较低。肿瘤细胞由于生物化学代谢异常，细胞膜、细胞被膜中L-岩藻糖升高，其作用机制尚不分清楚，可能与肿瘤免疫逃逸有关，或与肿瘤特异性受体暴露有关；血清L-岩藻糖随细胞膜、细胞被膜中L-岩藻糖含量升高而升高。Parwani等[39]发现，OSCC患者的平均血清L-岩藻糖浓度是正常对照组的3倍。在Rai等[40]的一项研究中，对照组、OLK组及OSCC组每组纳入20名研究对象，测得血清L-岩藻糖浓度依次为（5.29±2.18）、（8.95±1.92）、（13.85±4.34）mg·dL-1，两两比较P值均小于0.05，表明血清L-岩藻糖水平在正常人、OLK患者、OSCC患者中呈上升趋势。Chinnannavar等[41]发现，不仅血清唾液酸和岩藻糖平均水平从对照组到OSCC组均呈上升趋势，且相应的比值呈下降趋势。

血清唾液酸、L-岩藻糖等糖缀合物水平的升高以及唾液酸与岩藻糖比值的下降水平可作为OPMD的征兆，是早期细胞发生变化的指示物。糖蛋白的生物化学变化始于肿瘤发生的早期阶段，如果常规监测血清唾液酸水平，可以在早期检测到口腔恶变的发生。在评估口腔相关恶性疾患血清糖缀合物水平时，应排除其他退行性疾病、增殖性疾病及除口腔外的恶性肿瘤等疾病的干扰，因为在上述病理情况下，血清唾液酸、L-岩藻糖等糖缀合物水平也会出现不同程度的升高。

5 炎症相关标志物

慢性炎症状态可导致细胞过度增殖和活化，造成不可逆的DNA损伤。多项研究表明，肿瘤细胞能够表达多种炎症相关因子，最常见的是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6以及IL-8[42-44]。上述细胞因子具有调控血管形成的作用，与肿瘤血管密度增加和不良预后相关，对肿瘤的生长具有重要的影响。炎症过程中TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8等细胞因子的释放能够促进肿瘤的生长，同时肿瘤的生长又能进一步激发炎症反应，造成恶性循环。有学者[42-46]报道了在OPMD和口腔癌患者中，血清TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8水平呈上升趋势，且随病情的不断进展，其浓度也不断地增高。除了肿瘤细胞自身能够分泌炎症相关因子之外，其还能诱导某些炎症相关因子的合成和分泌，如C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）等。

5.1 C反应蛋白

CRP是指在机体受到感染或组织损伤时，血浆中一些急剧上升的蛋白质（急性非特异性蛋白），它们能够激活补体，加强吞噬细胞的吞噬，清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞，几乎都由肝脏产生。当机体发生感染、创伤、坏死、自身免疫或者恶性疾病时，CRP可以升高至1 000倍。由于肿瘤的生长与组织炎症有关，血液中逐步升高的CRP水平可提示患者具有恶性肿瘤发生的风险。

Pepys等[47]发现，OPMD患者中血清CRP水平升高。随后Kumar等[48]和Bhattacharjee等[49]进一步证实了CRP在OSF和OLK患者血清中都有不同程度的升高。Chang等[50]的一项研究结果表明，口腔癌复发患者的IL-6、CRP及血清淀粉样蛋白A均维持在较高水平；另一方面，当血清CRP≥2 mg·L-1、E-选择素≥85 ng·mL-1时，则具有较高的复发风险。

5.2 基质金属蛋白酶

MMP是细胞外基质降解酶家族的总称，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。在转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β和IL-8的刺激下，巨噬细胞、嗜中性粒细胞和成纤维细胞分泌MMP。MMP几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，破坏正常的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起重要作用，在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶，尤其是MMP-9和MMP-2。Patel等[51]发现了与毗邻的正常组织相比，口腔癌病损中MMP-9和MMP-2的表达及活性均明显升高，且MMP-2上调的水平较MMP-9更为显著；伴有淋巴结转移的口腔癌患者与无淋巴结转移患者相比，其MMP-2和MMP-9的活化程度也有明显的升高。随后Lotfi等[52]的一项关于口腔癌患者血清MMP-9、MMP-2水平的结果显示，OSCC患者的血清MMP-2和MMP-9水平同样也显著升高；血清MMP-2和MMP-9水平与性别和年龄无关，但与吸烟呈正相关；同时该研究也发现了血清MMP-2水平与淋巴结转移和肿瘤分期呈正相关，而血清MMP-9水平只与淋巴结转移呈正相关，与肿瘤分期关系不大。

炎症在口腔组织癌变的病理进展中有着重要的作用，通过检测血清炎症相关标志物，临床医生能够早期评估癌变和复发的风险。

6 抗氧化剂

抗氧化剂具有一定的自由基清除能力，能够对抗自由基和活性氧引起的氧化应激反应，在机体的防御系统中起着重要的作用。维生素C是主要的水溶性抗氧化剂，是全血和血浆中主要的抗自由基成分[53]。维生素C与恶性病变可能相关机制如下：1）抗氧化剂，氧与氧自由基竞争性结合，使氧自由基含量降低同时修复损伤，这有助于维持正常细胞的完整性；2）维生素C减少维生素E的降解，从而增强趋化性、吞噬作用和胶原合成，此外，维生素E能够维持细胞膜的完整性，从而抑制癌细胞的生长和分化；3）维生素C能够抑制亚硝胺的形成并使癌基因低表达[54]。Bhat等[55]研究表明，在健康对照组中平均血清维生素C的浓度为1.379 mg·dL-1，而在患有OPMD的患者组中，平均血清维生素C的浓度下降至1.1 mg·dL-1，口腔癌患者中的平均血清维生素C水平为0.783 3 mg·dL-1。血清中维生素C含量的降低以及由此产生的氧化损伤可能在口腔黏膜癌变中发挥着重要的作用，对血清维生素C的检测评估有助于对OPMD和口腔癌进行早期诊断及预后判断。

7 微小RNA

微小RNA是一类进化上保守的非编码小分子RNA，具有在翻译水平调控基因表达的功能，与细胞的增殖、分化、侵袭等有关。微小RNA的失调与人类多种疾病的发生相关，包括癌症的发生发展。微小RNA不仅能够调控原癌基因、抑癌基因的表达，其本身还可能作为原癌基因、抑癌基因而起作用。Yu等[56]报道了与健康人相比，在OSCC患者组织中，微小RNA-372、373的表达上调，且过表达的微小RNA-372、373与淋巴结转移、淋巴血管浸润及不良预后相关；他们的研究还证实了微小RNA-9在OSCC组织和细胞系中明显下调，并可能作为肿瘤抑制因子在OSCC中发挥作用。随后Sun等[57]的研究证实，血清微小RNA-9在OSCC患者和OLK患者中下调，此外，低血清微小RNA-9与OSCC预后差相关，提示微小RNA-9可能在OSCC中发挥肿瘤抑制作用。除此之外，微小RNA-21、345、181b、155、196a、196b、197、21、125等多种微小RNA均与口腔黏膜癌变相关，且在血清中的浓度呈不同程度的上升趋势[58]。

8 小结

以上七大类物质是目前研究最多的口腔黏膜癌变过程相关的血清生物化学物质，除以上所述的几种物质外，OPMD和OSCC患者的血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、鳞状细胞癌抗原、表皮生长因子受体、G1/S-特异性周期蛋白-D1、趋化因子（CCL2、CCL3）等、组织多肽特异性抗原、一氧化氮和超氧化物歧化酶等的表达水平均有不同程度的变化。近几十年来，生化学家和免疫学家一直致力于研究分子变化与恶变之间的关系。在口腔黏膜癌变的发生、发展过程中，血清中的各种生物化学物质在早期即可发生量甚至质的变化，或者可以认为这些物质的改变同时也会导致或促进肿瘤的发生及发展。

众所周知，癌细胞合成、分泌的生物化学分子能够在体液中被检测到，这一点推动了寻找新的恶变标志物和发明新的生物化学方法来早期识别、诊断乃至治疗恶性病变。准确的诊断和及时的治疗能够在一定程度上防止OPMD向OSCC的转化，但目前该种检测手段并未应用到临床实践中。值得注意的是，目前文献所报道的血清潜在生化标志物都是非特异性的，在用于OPMD和OSCC的早期诊断、进展监测时一定要排除其他恶性肿瘤及系统性疾病的影响。