绵羊冷冻精液稀释液成分的研究进展

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750000）

随着我国农牧业的发展，养羊业已经成为我国一项重要的产业，但是我国绵羊品种良种化程度较低，生产力水平不够，应建立健全良种繁育体系，适应现代养羊业发展的需要。我国自60年代以来，对绵羊冷冻精液的研究和应用都取得了较大的进步，绵羊的人工授精是我国养羊业生产中常用的技术之一，利用人工授精可以扩大优良绵羊品种的利用率、减少引种费用和饲喂种公羊的费用，而且还可以提高母羊的受胎率。稀释液成分对精子有良好的保护作用，可以防止低温对精子的危害、具有提供缓冲物质、供能、抑制细菌生长等作用。近年来，为了提高绵羊精液的冷冻品质以及冷冻效果，许多研究者在稀释液成分方面研究日益增多。本文对国内外绵羊精液稀释液相关成分研究进展进行综述。

1 抗冻保护剂

精液的冷冻是指精液保存在液氮（-196℃）或者干冰（-79℃）的超低温条件下，使精子的代谢几乎停止，处于休眠状态。为了防止超低温对精子的伤害，抗冻保护剂可以使精子在低温冷冻时保护精子，延长精子的存活时间。抗冻保护剂根据细胞膜的通透性可分为高膜透过性和低膜透过性两种类型。在没有防冻剂的情况下，精子在冻融过程会发生精细胞脱水、细胞膜结构损伤、蛋白质变性等危害，探索良好的抗冻保护剂非常重要。常见的抗冻剂有卵黄、甘油、乙二醇、二甲亚砜、肌醇、有机盐以及一些糖类等。

1.1 高膜透过性防冻剂

目前在绵羊精液中添加的膜透过性较高防冻剂种类较多，主要以甘油、乙二醇、酰胺类物质为主。甘油作为一种通透性很强的保护剂，是绵羊精液最早使用的抗冻保护剂，一般浓度为4%～6%，其在精液中可以降低细胞内溶质的浓度，阻止精子细胞蛋白质的变性。甘油进入细胞内外，可以减缓细胞的脱水速度，避免精子细胞发生渗透性损伤，但甘油会损伤精子的结构并影响一些酶的活性[1-5]。在筛选比较甘油、乙二醇、乙酰胺对公羊精液的保存效果时发现，5%甘油比其他冷冻保护剂的质膜完整性更高，甘油（5%）和乙二醇（3%或5%）的联合使用，可以使精子运动能力更大，并且研究发现5%甘油对精子质膜可以提供更好的保护[6]。刘玉峰等[7]发现用浓度为5%的乙二醇冷冻绵羊精液可以提高冻后精子的顶体完整率，其冷冻效果优于甘油。但研究也表明用乙二醇作为猪精液的冷冻保护剂，导致精液尾部畸形精子较多，可能对精子也有一定的损害作用[8]。精子经过冷冻后细胞结构的完整性至关重要，研究发现十二烷基硫酸钠（SDS）可以保护精子膜结构，能够保护精子的顶体与质膜的完整率[9]。同时宋玉坤等[10]发现在绵羊冷冻精液中添加1%的十二烷基硫酸钠（SDS）可以显著提高冷冻解冻后精子的成活率。曹访等[11]对不同冷冻保护剂（乙二醇甲醚、乙二醇、丙三醇、1，2-丙二醇、甲醇、二甲基亚砜等）进行筛选发现，乙二醇与丙三醇对精液的冷冻保存效果最佳。在缺乏蛋黄的山羊精液中添加二丁基羟基甲苯（BHT）可以提高冷藏精液的活力，以及冻融精子的活力（48.5%）和受精能力（62.5%），所以二丁基羟基甲苯可以代替来自动物源性的蛋黄，减少某些疾病的传播[12]。

1.2 低膜透过性防冻剂

低膜透过性防冻剂不但不需要添加基础液，还可以起到调节渗透压的作用，常见的有蔗糖、乳糖、麦芽糖、肌醇、抗坏血酸钠以及TEST液等。卵黄作为非渗透性的防冻剂，因为其含有卵固醇，早期研究发现它可保护精子免受冷休克的破坏作用，保持精子的活力，减少顶体酶的损失[13]，蛋黄可以降低甘油的浓度，减少甘油对精子的损伤，是稀释液中常加的一种物质。毛冉等[14]通过比较不同糖类（葡萄糖、D-半乳糖、果糖和蔗糖）对绵羊精液的保存效果，发现葡萄糖、D-半乳糖和果糖的混合糖效果较好，蔗糖组效果较差。海藻糖是一种非渗透性的二糖，容易形成氢键，可以降低水分子的转动速度，避免生物膜的脱水损伤，研究发现在精液中添加海藻糖可以减少冰晶对细胞的伤害[15,16]。随着科学技术的发展，近年来一些无动物源性的抗冻保护剂逐渐被开发，如用大豆卵磷脂替代卵黄，能够延长绵羊精液低温保存的时间，以及一些其他植物的提取成分也可以作为抗冻剂，且效果明显[17-20]。

2 抗氧化剂

活性氧对维持精子正常的生理功能至关重要。一般在精液中添加的抗氧化剂有维生素、氨基酸、酶、植物提取物等，这些抗氧化剂的机理大部分是与自由基的结合，形成抗氧化成分，以保护精子。公羊精子在体外也具有抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶，以及非酶抗氧化剂等。在酶的作用下，精子在体外可以减少氧化[21]。

2.1 维生素族抗氧化剂

抗坏血酸作为一种常用的抗氧化剂，它可能通过防止对精子DNA的氧化损伤来维持精子细胞的遗传完整性[22]。维生素B12是另一种水溶性维生素，它以辅酶的形式参与各种代谢过程，维生素B复合物可以提高精液解冻后的活力，并在冷冻保存过程中保护精子膜的完整性[23]。同样Hu等[24]发现维生素B12可以保护精子在冷冻过程中免受膜脂质的过氧化作用，所以在精液冷冻过程中，可以添加B12 能减少精子在冷冻过程中的损伤，从而提高精子的活力。维生素E是一种亲脂性抗氧化剂，可保护组织中的多不饱和脂肪酸免于过氧化，在冷冻精液中添加维生素E可改善精液的活力和精子膜完整性[25,26]。

2.2 酶与氨基酸类抗氧化剂

部分酶类在精液中可以起到很好的抗氧化作用，如超氧化物歧化酶（SOD）可以保护顶体的完整性，增强线粒体的活性，以期延缓精子的寿命[27]。过氧化氢酶已被用于抗氧化剂运用在绵羊精液当中，以提高精液的抗氧化能力并保持精子功能[28]。研究发现在冰冻融化的公羊精液中，添加谷胱甘肽可以提高精子的活力，增加谷胱甘肽过氧化物酶的活性[29]。

氨基酸类抗氧化剂也存在于精浆当中，常见的有脯氨酸、牛磺酸、亚牛磺酸、组氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、半胱氨酸等。脯氨酸可以减少脂质的过氧化作用，并能够穿透精子，从而抑制细胞内冰的形成，Sharon等[30]将谷氨酰胺和脯氨酸作为冷冻精液的抗氧化剂加入到精液中，发现可以防止冷冻对精子的伤害并改善冷冻前后的精子的性状。蛋氨酸是谷胱甘肽的前体氨基酸，可保护细胞免受氧化损伤，蛋氨酸与棉子糖共同使用可以防止冷冻对精子DNA的损伤[31]。半胱氨酸容易穿透细胞膜，增强了细胞内谷胱甘肽的合成，防止在精液储存或冷冻状态下精子丧失运动性，在精液中添加半胱氨酸和牛磺酸可以提高精子顶体和整体形态的完整性、增加精液的抗氧化力[32]。褪黑素是色氨酸的衍生物，它通过与自由基的结合并通过一系列过程形成抗氧化成分，增加一些抗氧化酶类的活性、提高精子DNA的完整性、保护顶体的完整性等优点，常添加在精液中作为一种抗氧化剂[33-35]。

2.3 植物提取物抗氧化剂

近年来，研究者从植物中提取有效成分用来作抗氧化剂，并起到了很好的效果。白藜芦醇是一种非黄酮类多酚类复合物，其可以参与精液的氧化还原调节，自身可以产生抗逆性的物质，研究发现白藜芦醇可以提高家畜冻精的品质[36,37]，吕春荣等[38]发现在山羊冷冻稀释液中添加适量浓度的白藜芦醇可以改善山羊冻精质量。从大豆植物中提取的大豆异黄酮，因为其含有酚羟基，可以与自由基结合，从而抑制氧化，研究发现在种公羊精液稀释液中（常温）添加0.10 mmol/L的大豆异黄酮可提高精液保存效果[39]。吴琳[40]发现在猪常温精液中添加抗氧化剂丹参酮IIA、芦丁和灵芝多糖显著增强精子的活率，且显著促进精子的抗氧化酶能力，降低了脂质过氧化反应的发生。李宇[41]发现在山羊精液中添加中药抗氧化剂提取物3.0 mg/ml淫羊藿多糖，可以提高冻融后精子的质量，改善精子的总抗氧化水平，对精液冷冻保存具有保护作用。没食子酸是一种天然抗氧化剂，研究发现在精液中添加它可以显著提高后精子的活率，并降低精液中活性氧以及脂质过氧化产物的含量[42]。鞣花酸属于多酚二内酯的一种，它能够通过清除精子细胞内的自由基，提高总抗氧化能力，减低精子的损伤[43]。椰子油里含有多种抗氧化剂成分，研究发现在Tris基础液中添加8%的椰子油与不同浓度的蛋黄结合使用可以提高牛精液的冷冻保存效果[44]。

2.4 其他抗氧化剂

精子的氧化损伤是冻融精子活力下降的主要原因之一，二丁基羟基甲苯（BHT）作为抗氧剂经常作食品添加剂，能延迟食物的酸败，研究发现在冷冻精液中添加BHT可以改善精子的运动能力和存活能力，增加顶体的完整性[45]。M Eslam[46]等发现添加棕榈油酸酯可改善绵羊精液在储存过程中精子的活性，提高总抗氧化剂活性水平，所以棕榈油酸酯可以作为公羊精液在存储中的抗氧化剂。尿酸盐是动物精液中的主要抗氧化剂之一，在精液中添加它可以中和自由基，保持一些酶的活性，有助于保存和增强精子的活力，保持其形态，但过量的尿酸盐能降低精液中一些酶的活性[47]。

3 维持渗透压物质

渗透压对精子有很大的影响，精子与周围的环境基本是等渗的，如果精清部分的盐类物质浓度过高，则会导致精子脱水，反之，会导致精子膨胀，造成精子运动变慢，甚至死亡。冷冻保存会影响精子的渗透耐受性和细胞内离子浓度[48]，所以良好的渗透压物质能平衡精子内外渗透压，以保护精子的正常形态。常见的维持渗透压物质有糖类和盐类，其中糖类物质有葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖等，糖类物质不但可以调节精液的渗透压，还可以为精子提供能源物质，使其保持活力。盐类物质有柠檬酸盐、重碳酸盐、磷酸盐、硫酸盐等，不但可以调节精液的渗透压，还可以稳定精液的pH值。国内外主要以Tris为缓冲物质，效果良好，且对精子损伤较小。环糊精是直链淀粉转化而来，其可以降低挥发性的作用，研究发现用环糊精处理山羊精液会增加精子胆固醇含量，不但可以提高解冻后精子的活力和顶体完整性，还可以提高精液的渗透耐受性[49]。

4 抗菌物质

精液本身或者在采精、精液稀释以及人工授精的同时，会受到细菌或有害微生物的污染，常见的细菌有沙门氏菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属等。精液中添加抗菌药物，可控制细菌的污染和生长，提高精子的活力，且随着药物浓度的增加，抑菌效果越明显[50]。常见的抗菌药物有链霉素、青霉素、林可霉素、庆大霉素、土霉素等，该制菌物质一般属于广谱抗生素，对精子的损伤很小。精液中的微生物可以使精子质膜的超微结构发生损伤，影响受精率[51]。茆达干等[27]为了筛选较好的抗菌药物，在山羊精液中分别添加恩诺沙星、庆大霉素、氧氟沙星、青链霉素菌特灵等，结果发现在精液中添加 50 μg/ml的恩诺沙星的低温保存效果优于其他抗生素。但长期抗生素会增强抗生素的耐药性，会进一步增加细菌的感染性。近年来，国内外都在寻找可以代替抗生物的最佳替代品，如一些植物提取物、人工合成物等。淫羊藿苷是一种中草药提取物，其不但有抗氧化的作用，研究发现其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌也有一定的抑菌作用，且效果与庆大霉素相似[52]。国内研究发现中草药提取物绿原酸、石榴提取物安石榴甙、Lε-聚赖氨酸都可以抑制精液中细菌，对精液有一定的保护作用[53-55]。

5 小结与展望

随着畜牧业的发展，科技工作者为了提高绵羊冷冻精液的保存品质，在稀释液中添加了种类繁多的添加物，以期找到更好地添加剂。人工授精技术为是绵羊的改良的一项重大革新，为畜牧生产提供了便捷，而冷冻精液可长期保存，运输简易，且生物安全系数高。稀释液是精子的保护剂，可以减少精子在冷冻过程中的损伤，部分稀释液成分因动物的种类的不同其效果也有差异，起作用效果机制还不太明确。目前研究主要集中在寻找具有多种性能的添加剂并探究其作用机制，如一些糖类不但可以提供能源，还能起到防冻作用，一些植物的提取物也有良好的效果，以及用一些无动物源性的添加剂来代替卵黄，减少某些疾病的传播。所以加强精液冷冻技术在生产实践中的使用，会为羊业生产带来更多的效益，而稀释液的种类、品质、技术也会进一步提升。