苦龙胆酯苷在疾病发展及治疗中的研究进展

王懿哲 李珂 谈亚姣 姜朋涛

西安医学院，陕西 西安 710021

中医药及其有效成分的研究在疾病预防和治疗中发挥着重要作用［1，2］。发现及利用这些中医药资源对医学的发展具有重要意义。苦龙胆酯苷（Amarogentin，AG）是一种天然裂环烯醚萜苷类化合物，属于中药獐牙菜属植物的活性成分之一，是目前该类化合物中已知最苦的。在传统医药学中被用来治疗多种类型的疾病。在实验动物模型体内药代动力学过程符合二室模型，即在静脉给药途径中，药物在中央室的分布相对于周边室较快，并且几乎无体内毒性作用。近年关于对苦龙胆酯苷的研究表明其具有抗氧化、调节脂质代谢和调控免疫功能等作用；同时在多种疾病的发展中起到抑制和治疗作用。本文旨在综述苦龙胆酯苷相关研究进展，为后续研究提供指导。

1 苦龙胆酯苷概述

1.1 来源 苦龙胆酯苷是獐牙菜属药用植物的主要有效成分。该属植物来源以龙胆科獐牙菜属为主，在我国主要分布在西南地区。有文献报道从川东獐牙菜、印度獐牙菜、龙胆草、辐花肋柱花等植物中提取的方法及化学合成方法，以獐牙菜为原材料的提取方法中，乙醇法萃取正丁醇部位提取的苦龙胆酯苷定粗提粉末获得率为（18.33±1.20）%，最终纯化后用高压液相检测仪测得纯度大于99.21%［3］。但未有报道能够完全人工合成苦龙胆酯苷，仅能合成部分分子基团［4］。

1.2 理化性质 苦龙胆酯苷属于离子型药物，药物极性高，不易通过细胞膜脂质层。室温下水中溶解度仅为0.27mg/mL；乙酸乙酯中可以达到12.1mg/mL；甲醇中溶解最好，溶解度超过100mg/mL。体积分数20%PEG400可以显著提高苦龙胆酯苷在水中的溶解度，对动物安全无害，不会影响药物的检测，是非常适合的助溶剂［5］。

1.3 活性测定 通过在龙胆科植物中建立抗AG单克隆抗体定量检测AG含量，以此推断龙胆科植物提取物的潜在活性。研究表明，间接酶联免疫方法检出范围为 1.95～62.5ng/mL，检出最低值为 1.28ng/mL，与传统高效液相色谱相比灵敏度提高了30～625倍，批内变异＜3.9%，批间变异＜8.8%，加标样品回收率在91%～106.4%之间，与之前所报道的其他定量分析方法相比更为廉价和环保［6］。

1.4 苦龙胆酯苷的医药学应用 獐芽菜大多性寒味苦，在传统中医药学、藏医药学及印度医药学中，被以多种形式来治疗发热和肠道疾病；同时还有降血糖、护肝、驱除肠内寄生虫、抗肿瘤等作用。文献报道［7］，将其叶和剁碎的根茎在水中浸泡过夜用来治疗高血压和偏头痛，还有其他形式的用药方式用其治疗包括疟疾、瘴气、皮肤疾病（疱疹，湿疹等）、胃肠道疾病（腹泻，呕吐等）、溃疡、肾脏疾病、蝎子咬伤、月经量过多等。同时认为它是一种无毒的传统医学用药。

1.5 毒性作用和体内代谢 对于任何一种理想的药物来说，其合成或来源的简易性、药物自身稳定性、口服可用性、良好的药物代谢动力学特性、组织毒性、成瘾性都是至关重要的。目前尚未有报道表明苦龙胆酯苷在实验动物模型中出现毒性作用。口服1000mg/kg剂量下测定AG的急性中毒时未发现任何毒性作用，所有动物在 14 天后仍然存活［8］；在 0.2μg/kg·d 剂量给药条件下30天后，将小鼠处死，其肝脏、肾脏、心肌、肺与对照组相比未出现异常变化［9］；在AG作用后在血液病理学，组织学染色，以及肝功能相关的特异性酶的检测中表现无毒性［7］。药物半衰期和血浆清除率均比较稳定，且消除迅速，静脉注射AG在家兔体内的药物代谢动力学研究报告显示，AG具有较快的血浆清除率和广泛地组织分布，其消除半衰期约为30min［8］。苦龙胆酯苷口服生物利用度低，当给药量提高至50mg/kg时，仍然无法在血浆样品中检测出。在给药6.25～25mg/kg，药物的最大血药质量浓度（Cmax）与给药量的改变不成正比［5］。

2 苦龙胆酯苷的研究进展

2.1 苦龙胆酯苷与肝纤维化及肝癌 肝纤维化是由于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病等引起的肝内结缔组织的异常增生，而这些病因长期存在于机体就会导致肝硬化的形成，最后恶化形成肝癌。2018年，全球约有84万新发肝癌患者，发展中国家的发病率占大多数［10］。因此在肝纤维化期的预防和肝癌形成后阻断其发生发展都极为重要。

AG可以调节氧化应激过程及MAPK通路影响代谢而表现抗肝纤维化［11］，AG 作用后，ALT、AST 及 Hyp水平与对照组相比明显降低。并且AG处理后大鼠肝脏炎症细胞浸润及胶原沉积程度明显减少，提示AG对CCl4诱导的肝纤维化有改善作用。还通过其抗氧化活性调节氨基酸的合成以及氧自由基对肝细胞的损伤。AG基于对色氨酸代谢障碍的调节逆转5-羟基吲哚-3乙酸和吲哚乙酸在肝纤维化小鼠血浆中的含量降低。AG调节肝纤维化小鼠脂肪酸的代谢紊乱，改善了血清中的低能量水平［12］。

在采用四氯化碳/N-亚硝基二乙胺诱导的小鼠肝癌模型中，AG持续治疗处理后小鼠存活率升高，体重增加；治疗组Bax-Bcl2的表达上调、caspase-3活化、聚ADP核糖聚合酶裂解从而诱导细胞凋亡。对照组在第10、20、30周时分别出现中重度异性增生及肝细胞癌。表明AG能在轻度发育不良期阻断肝癌的发展。从第10周开始，AG处理组中LIMD1、RBSP3和p16的表达明显增加，cdc25A明显降低，导致了CDK2/4/6的表达下调，进一步导致了在第20周时ppRb807/811和ppRb567的表达下调，由此限制了细胞的增殖，p53和p21在第 20周和cMyc、cyclinD1、mdm2在第30周的下调可能通过调节细胞周期而发挥协同作用［13］。研究表明［14］，有0.5%～2.5%的肝癌起源于肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs），同时，也与肝癌的复发，肿瘤转移，放化疗的耐药有关。同样在采用四氯化碳/N-亚硝基二乙胺诱导的小鼠模型中与肿瘤对照组相比，AG在肿瘤发生的前后均能显著下调CD44阳性CSCs细胞的数量。在肝损伤病灶中，AG影响Wnt信号通路，明显抑制βcatenin、phosphob-catenin（Y-654）的表达，可能是由于上调了Wnt通路antagonists sFRP1/2和APC的表达。在Hedgehog通路中，AG下调了Gli1，sonic hedgehog ligand和SMO的表达，上调了PTCH1的表达。在肝损伤组织中，AG上调上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin），下调表皮生长因子受体（EGFR）。体外实验证实，AG对HEPG2细胞株的生长具有剂量依赖的抑制作用，且与CD44阳性细胞的数量呈相关性［14］。AG能够抑制肿瘤细胞的迁移，在24、48和72h时，AG对LO2细胞的半数最大抑制浓度（IC 50）分别为173.93、141.0和115.5μg/mL，对 HepG2细胞的 IC 50分别为 132.90、110.30和78.61μg/mL，对SMMC-7721细胞的IC 50分别为 181.15、123.78 和 86.67μg/mL。p53 在移植瘤（HepG2、SMMC-7721）小鼠模型体内的关于AG的研究，对照组肿瘤组织重量明显大于预防组，但仅略大于治疗组，表明其潜在的预防作用可能更为重要。免疫组化、WB以及q-PCR等方式对相关基因表达的检测表明，苦龙胆酯苷可能是通过提高p53以及下调端粒逆转录酶、Akt和NF-κB P65的表达来诱导肝癌细胞的凋亡［9］。

2.2 苦龙胆酯苷与其他癌症 在肿瘤治疗过程中，诱导肿瘤细胞发生凋亡在肿瘤发展的控制及治疗中发挥重要作用。细胞凋亡障碍与肿瘤的发生密切相关。在不同的肿瘤细胞中广泛存在诱导凋亡的细胞产物。AG可参与β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）催化产生氢氰酸，从而抑制细胞色素c氧化酶、细胞色素c氧化酶的悬浮酶以及三磷酸腺苷的合成导致细胞死亡。而在多种肿瘤细胞中硫羟化酶的含量较正常细胞低，对产生的氢氰酸解毒能力不足，同时肿瘤细胞糖酵解中产生的乳酸增强氢氰酸的作用，使其杀伤肿瘤细胞的作用增强。所以AG具有特异性抗癌作用［15］。AG的抗癌作用首次被报道是在小鼠皮肤癌模型中出现的抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡作用［7］。在胃癌研究中发现，AG具有剂量依赖性诱导SNU-16人胃癌细胞早期、晚期凋亡作用。并且异种移植瘤小鼠体内的肿瘤体积明显小于未处理组，这一过程可能与AG过度活化PI3K/Akt下调相关通路蛋白的表达有关，PI3K/Akt通路在细胞凋亡，增殖，存活和分化中起到重要作用，磷酸化Akt通路可以促进细胞存活能力及增殖，而Akt激酶的过度表达和激活与恶性发展密切相关；另外，cyclin D1和cyclinE的表达明显上调则诱导G2/M时相细胞周期的抑制。有报道称PI3K/Akt信号通路在非小细胞肺癌及子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的发生中起着关键作用，所以AG也可能会参与这些癌症的抑制过程［16］。AG还能够对儿茶素（EGCG）抑制宫颈癌的发生、发展产生协同作用，联合用药时诱导凋亡的效果远大于单一用药组，抗凋亡蛋白的表达与单一用药组相比明显下调，其他细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达也表现出明显差异，并且提升G1/S细胞周期的阻滞作用［17］。

2.3 苦龙胆酯苷与糖尿病 糖尿病是一种基于胰岛素分泌绝对或相对不足而引起的以血糖升高为主要表现的代谢性疾病，主要分为两类，胰岛素依赖性糖尿病（T1MD）和胰岛素非依赖性糖尿病（T2MD）。目前在全球约有4.25亿成人（20～79岁）糖尿病患者，而在我国有约1.14亿［18］。AG对T1MD大鼠模型的高血糖改善情况呈剂量依赖性，在大鼠体内能够逆转骨骼肌中GLUT的下降和下调肝脏中已升高的PEPCK的表达。口服葡萄糖耐量实验结果也表明AG以剂量依赖性的方式产生降低血糖的作用，其作用在60min时最明显，且这种作用与葡萄糖诱导分泌内源性胰岛素水平增高无关。并且在T2MD大鼠模型体内，AG能够增加胰岛素敏感性［19］。还有研究表明AG能够改善小鼠糖尿病模型血脂水平和肝功能［8］。

2.4 苦龙胆酯苷与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是目前心脑血管类疾病形成的主要原因之一，其主要的病理特点是动脉管壁上的异常脂质堆积。流行病学调查显示，全球每年约有2000万人死于动脉粥样硬化相关疾病。AG通过与AMPK的α2亚基相互作用使其活化，并且诱导AMPK及其下游靶点乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化，从而增强了肌管对葡萄糖的摄取，阻断肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的内皮炎症反应。内皮炎症产生的胶原和脂质的沉积是动脉粥样硬化斑块形成的核心，口服AG可以减弱糖尿病介导的新生内膜的增厚以及脂质在主动脉内膜的沉积，有效降低血液中甘油三酯，低密度脂蛋白，极低密度脂蛋白水平同时提升高密度脂蛋白的含量，降低胶原蛋白的重要组分羟脯氨酸的含量。AG还可能通过抑制PLC 2-PKC-p47级联和MAPK信号通路而消除血小板活化，抑制人血小板中胶原诱导的血小板聚集，减少血栓形成。表明其具有治疗闭塞性大血管病变的潜能［8，20］。

2.5 苦龙胆酯苷与皮肤病 AG抑制肥大细胞合成肿瘤坏死因子，进而抑制IL-8、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的表达，还可间接影响神经细胞生长因子和IL-6且这种作用与AG的体内苦味受体（TAS2R1和TAS2R38受体）相关［21］。AG能够通过诱导表皮神经酰胺合成酶-3的表达调节人角质细胞的脂质合成，改善皮肤屏障问题，例如皮肤干燥和特应性皮炎等［22］。这种对人肥大细胞和角质形成细胞的免疫调节作用使AG具有缓解皮肤炎症及瘙痒、支气管扩张等慢性炎症性疾病的潜质，同时，AG对组胺的释放无影响［21］。

2.6 苦龙胆酯苷与黑热病 黑热病是一种由杜氏利什曼原虫引起的经白蛉传播的慢性传染病，主要引起肝、脾、骨髓、淋巴结损害和免疫功能低下。AG通过与杜氏利什曼原虫DNA拓扑异构酶-1结合，抑制该酶与DNA的结合形成二元复合物，从而杀死体内杜氏利什曼原虫［7］。因此在黑热病的治疗中发挥重要作用。

3 小结和展望

AG作为一种中草药活性成分，其在传统医学和现代医学领域都有较好的医用价值，在我国古代医药典藏记录中，AG被用来治疗多种类型的疾病，通过本文综述可知，AG能够阻断小鼠肝纤维化、肝癌、皮肤癌以及人胃癌细胞系和宫颈癌细胞系的发生发展，阻断动脉粥样硬化的形成，治疗皮肤屏障引起相关皮肤病，改善糖尿病小鼠模型的代谢功能和通过阻断杜氏利什曼原虫的体内繁殖来治疗黑热病的作用。

实验动物体内，AG在多个领域的治疗作用已被证实，表明其在未来具有良好的作为临床用药的潜质，但其相关的具体机制仍然不十分清楚，并且缺少毒理学研究，需要在实验动物体内进行毒性作用和相关机制的探究，以评估在人体内应用的安全性问题。同时缺乏一些有效的生物学工具进行研究，比如目前存在的问题在于需要一个合适的单克隆抗体能够使AG和β-Glucosidase的结合，以用来治疗肿瘤［15］。

目前，对于AG的研究已经取得了巨大的进展，但是实验结果均基于细胞和动物实验，而且关于AG剂量、剂型的研究不多，所以限制其使用，这也将是以后的研究重点之一，临床实验表明，以脂质体为载体递送药物的方式已经是治疗肿瘤、真菌和其他寄生虫感染的最好选择，文献报道在仓鼠体内实验证明以脂质体和游离体的形式给药所表现出的药物活性和安全性更高［7］。另外，目前的数据远不足以提供临床指导作用，有学者进行预实验表明，AG能够抑制胶质瘤的发生发展，但是由于药物本身性质，对于其能否通过血脑屏障需要实验证实。