铜绿假单胞菌相关sRNA研究进展*

李虹霖 综述，陈 茶 审校

(1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510006；2.广州中医药大学第二附属医院检验医学部，广东广州 510006)

细菌调控小RNA(sRNA)是一类长度为50～500个碱基的RNA，广泛分布于各类细菌中，不含开放阅读框，通常由基因间区转录而来，也有小部分位于基因编码5′和3′UTR区[1]。sRNA通过碱基互补配对与靶基因或靶标蛋白质结合，影响信使RNA(mRNA)的稳定，从而参与基因的转录后表达调控，发挥多种生物学功能[2]。例如，在致病菌的新陈代谢、脂多糖修饰、生物膜形成、外膜蛋白合成、毒力产生、耐药性和群体感应等多个方面发挥重要调控作用[3-4]。近年来，研究者主要通过生物信息学模型预测sRNA的存在和可能的靶点，随着sRNA研究的深入，sRNA的功能研究逐渐成为研究热点。然而目前针对sRNA特别是铜绿假单胞菌相关sRNA的研究大都停留在新的sRNA鉴定方面，仅有少部分sRNA的功能被阐明。本文将在现有的理论和研究基础上，从铜绿假单胞菌相关sRNA的概念、分类、作用机制及生物学功能等方面进行阐述，旨在为铜绿假单胞菌sRNA进一步研究提供参考。

1 sRNA的分类

细菌sRNA的长度较短，其编码基因大都位于基因间区。sRNA具有独立的转录单元，转录产物通常不需要经过加工。按作用方式，大致可将sRNA分为3种:(1)与蛋白质结合的调控sRNA；(2)与mRNA相互作用的调控sRNA：反式编码sRNA、顺式编码sRNA；(3)规律成簇间隔短回文重复序列系统(CRISPRS/Cas)相关sRNA。

2 细菌sRNA的作用机制

随着生物信息及全基因组RNAseq技术的开发和改进，细菌中已鉴定的sRNA数量激增，但其在各种调控网络中的功能表征仍处于起步阶段。sRNA发挥调控作用，主要通过以下两种方式：(1)与相应的靶mRNA进行碱基互补配对，阻碍或促进蛋白质的翻译，以调控目的基因的表达；(2)与调控蛋白结合，影响蛋白构象，使其无法与靶mRNA结合，从而调控基因表达。

2.1sRNA与mRNA碱基互补配对 反式编码sRNA与其靶基因起源于不同的转录位点，在染色体上的位置距离靶基因较远，与靶基因仅有部分互补。反式编码sRNA的一般机制是通过与Shine-Dalgarno(SD)序列或起始密码子碱基配对来隔离靶mRNA的核糖体结合位点(RBS)，并且还可以与靶序列的编码序列相互作用，抑制翻译起始；与RNase形成核糖核蛋白复合体，作用于靶mRNA的RBS，降解靶mRNA，抑制翻译[5-6]；大多反式编码sRNA常与分子伴侣Hfq一起发挥调控作用。某些mRNA能够在5′UTR端形成抑制翻译的二级结构，而sRNA在Hfq的协助下能够结合到这种mRNA的5′UTR，从而阻止这种二级结构的形成[7]。

顺式编码sRNA是由编码靶mRNA的DNA链的互补链为模板进行转录的产物，存在一段序列与靶基因完全互补，具有高特异性、高亲和力的特点。由于顺式编码sRNA的反义RNA与靶mRNA是互补的，因此它们可以自主地相互作用，从而对靶mRNA转录后翻译进行调控。一般顺式编码的sRNA不需要Hfq辅助即可对靶mRNA进行调控。顺式编码的反义sRNA通常位于相应基因的UTR，在与靶mRNA形成二聚体后，通过改变其二级结构，从而影响mRNA翻译[8]。具体调控图，可见参考文献[1-2]。

2.2细菌sRNA与蛋白相互作用 除碱基互补配对外，sRNA还可通过与蛋白质结合而发挥调控作用。以铜绿假单胞菌的6 S RNA及CsrB/RsmZ家族为例。

在细菌中，6 S RNA十分保守且能够在稳定期积聚，它与σ70-RNA聚合酶能够结合形成稳定络合物，而这种结合依赖于6 S RNA的二级结构——大型中央隆起两侧的螺旋，类似于开放的启动子。然而，6 S RNA过表达或敲除无法引起细菌表型变化，对其功能研究还需不断探索[9]。转录因子CsrA通过与sRNA CsrB、CsrC特异性结合，减少CsrA与目标mRNA结合机会，封闭它的sRNA转录后水平调控，从而抑制目标mRNA的翻译。RsmX、RsmY、RsmZ等这类sRNA能调节铜绿假单胞菌Rsm系统中RsmA、RsmE RNA结合蛋白，并且GacS/GacA能激活RsmX、RsmY及RsmZ的表达[3,10]。在铜绿假单胞菌中，RsmZ家族主要调控T3SS分泌、细菌运动和生物膜形成等[11]。同时，CsrA/RsmZ在碳代谢、毒力、糖异生等多种生理过程中发挥调控作用[12]。此外一类作用于碳代谢相关基因的sRNA CrcZ/CrcY，可通过与Hfq一起结合，通过碳分解代谢物阻遏使铜绿假单胞菌适应环境，但具体机制不明[4]。

2.3与CRISP/Cas系统相关的sRNA 许多原核生物存在CRISP/Cas系统，其包含许多细菌的遗传基因元素，是一种RNA介导的用于外源遗传物质降解的适应性免疫防御系统[13]。最新研究发现，存在一类与CRISP/Cas有关的sRNA。一般而言，CRISPR位点由几个短的直接重复序列组成，由25到40个碱基对的独特序列分隔，Cas基因与CRISPR重复序列相连，两者之间存在前导序列发挥启动子作用，转录产生的非编码RNA命名为CRISPR RNAs(crRNA)，CRISPR/Cas系统利用与特定Cas蛋白关联的CrRNAs识别和消除外源噬菌体及质粒等遗传物质[14]。研究者利用CRISP/Cas系统可对基因进行编辑的特点，使其在基因组水平上的基因改造、转录调控与表观遗传调控等不同层次上得到快速的发展与应用。

3 铜绿假单胞菌相关sRNA的生物学功能

细菌在面对生存环境的改变如温度波动、有氧到厌氧的环境转换、pH值、碳源改变及抗菌药物作用等，通过sRNA调控自身状态以适应环境的变化。例如，在新陈代谢、脂多糖修饰、生物膜形成、外膜蛋白合成、毒力产生、耐药性和群体感应等多个方面发挥重要调控作用。目前，铜绿假单胞菌相关sRNA的研究大都停留在新的sRNA鉴定方面，仅有少部分sRNA的生物学功能被阐明。整理现有的理论和研究基础，可对其生物学功能总结如下。

3.1氧化应激 在铜绿假单胞菌中，sRNA PhrS启动子含有一个保守的ANR盒——氧化反应转录调节因子，PhrS在缺氧条件下具有独立的诱导作用。在氧缺乏时，PhrS通过与pqsR上游170个核苷酸的开放阅读框结合而促进pqsR的翻译[15]。在不同浓度H2O2刺激实验中发现，sRNA RgsA能够增强铜绿假单胞菌的抗氧化应激能力[16]，但具体机制没有揭示。近期有研究发现，RgsA在RNA酶RpoS的调节下使转录调控因子Fis和酰基载体蛋白mRNA的表达下调，而rpoS编码的σS亚单位在细菌的氧化应激中扮演重要角色，而这与氧化应激是否有关还需进一步验证[17]。

3.2碳代谢 细菌碳的吸收和利用是由一种被称为碳分解代谢抑制(CCR)的机制所控制的。在铜绿假单胞菌中，Hfq是CCR转录后的主要调节因子，其通过与编码碳利用相关酶的mRNAs RBS中富含A的序列结合，来阻止核糖体的负载。在碳源较少时，铜绿假单胞菌中的CrcZ合成得到增强，抑制碳代谢而适应环境的改变[4]。

3.3铁代谢 机体一般通过限制细菌对铁离子利用来抵抗感染。大多数病原菌的铁调控蛋白——Fur，可参与sRNA对铁的调控。在铜绿假单胞菌的基因间区存在sRNA PrrF，它包括2个95%以上的同源序列PrrF1和PrrF2，同时研究者在其上找到了Fur结合位点，与Fur蛋白一起调节铜绿假单胞菌体内的铁代谢[18]。在高铁环境下，Fur与Fe2+结合，抑制PrrF的编码，减少细菌对储存铁的利用；在低铁环境下，Fur与Fe2+脱落，诱导PrrF的产生，从而增加储存铁的使用，也可增加对铁的摄取。同时PrrF1、PrrF2以及两者间的基因序列能一起编码sRNA PrrH。PrrH转录起始于PrrF1的5′端，终止于PrrF2的3′末端，全长325个碱基[19]。研究发现，相对于PAO1野生株，PrrF1/PrrF2敲除株在低铁培养基中生存能力下降，毒力降低；动物实验也显示接种PrrF1/PrrF2敲除株的小鼠，在急性肺部感染期间细菌载量减少。然而，目前还没有研究证实PrrF和PrrH影响铜绿假单胞菌毒力的具体作用机制，需要进一步的研究去阐释。

3.4生物膜形成 细菌处于不利条件时，将合成由多糖蛋白质和核酸组成的生物膜，黏附在固体表面。生物膜使细菌在代谢、物质利用等方面具有独特优势，对抗菌药物和宿主免疫防御的抵抗性增强。在铜绿假单胞菌中，存在受双组分调节系统GacS/GacA控制的CsrB/RsmZ，其主要调控T3 SS的分泌、细菌的运动和生物膜等[11]。同时，PrrF1、PrrF2和PhrS也能够调控群体感应系统中喹诺酮信号分子(PQS)的合成，其对铜绿假单胞菌群体的生物膜形成有一定影响[20-21]。有研究发现，在大肠埃希菌和铜绿假单胞菌中，存在的sRNA MtvR负调控Hfq。这种负调控与hfqEc的5′UTR区结合有关。MtvR在大肠埃希菌 和铜绿假单胞菌中的表达能够调控多种表型，包括生物膜形成能力降低以及对各种抗菌药物敏感。

3.5外膜蛋白形成 细菌外膜(OM)是一种选择性屏障，用于废物的排出和少量营养物的进入，这一特性对于细胞在不利的环境中生存至关重要[22]。研究发现，大肠杆菌sRNA OmrA与OmrB通过下调几种外膜蛋白(OmpT、CirA、FecA和FepA)的合成以重组外膜[23]。典型的OMP是由ompF和ompC基因编码。在渗透压变化时，sRNA MicF和MicC分别抑制mRNA编码的OmpF和OmpC的翻译，从而调控细胞膜孔隙的大小以适应环境[24]。此外，在细菌应激过程中，sRNA RybB和MicA的转录被激活，其下调大肠杆菌中OmpC和OmpA等主要OMP的合成，从而减少未组装的周质OMP的积累[25]。然而在铜绿假单胞菌中有关调控外膜蛋白形成的相关sRNA研究尚少。

3.6群体感应 群体感应(QS)即细菌通过分泌一种或者多种酰基高丝氨酸内酯(AHLs或HSL)小分子，促进细菌个体间相互交流，协调群体行为的现象。QS一般由4部分组成：las、rhl、pqs和iqs[26]。细菌通过QS可以调控铜绿假单胞菌的运动、毒力产生、生物被膜形成及抗菌药物耐药等多种生理过程[27]。sRNA与QS系统存在着一种相互调控的关系。Gac/Rsm系统对正酰基高丝氨酸内酯(C4-HSL)和细胞外毒力因子(如氰化氢、花青素和弹性蛋白酶)的表达有积极的调节作用[28]。PrrF1、PrrF2通过抑制编码降解邻氨基苯甲酸的mRNA antABC而抑制邻氨基苯甲酸降解，从而促使PQS信号分子产生。PhrS与pqsR通过碱基互补配对直接促进pqsR的转录，PQSR蛋白直接作用于表达PQS信号分子合成的操纵子pqsABCDE，编码的酶能转化邻氨基苯甲酸为PQS信号分子[15]。近期有研究发现，ReaL受las系统的LasR负调控，并且通过转录后调控pqsC正向调控PQS信号分子的合成[29]。现在研究大部分集中于sRNA对PQS系统的调控，而对其他QS系统的研究较少。因此，sRNA与QS系统之间的调控关系仍然还需要大量的研究去探索。

3.7毒力因子产生 铜绿假单胞菌为适应环境，会产生外毒力因子，如氰化氢、吡咯烷、绿脓素和弹性蛋白酶等，而这些均与其毒力有关。以往研究表明，sRNA能调节毒力相关靶mRNA的稳定性或表达，以调控细菌对宿主的侵袭力。铜绿假单胞菌需要大量复杂的调控元件来控制其毒力系统的表达，如最近一份研究报告显示双组分AlgZR调控系统控制着几种重要毒力表型的表达，如铁依赖基因σ因子pvds、PrrF1、PrrF2、吡咯烷以及绿脓素[30]。目前，在有关铜绿假单胞菌相关sRNA功能研究的报道中，对绿脓素等表型的调控机制研究较少。

3.8细菌耐药 抗菌药物作为一种威胁细菌生存的环境压力，会诱导相应抵抗机制产生。KIM等[31]利用过表达手段发现，17个Hfq依赖的sRNA调控了大肠埃希菌对抗菌药物的敏感性，而敲除其中4个sRNA能逆转相应的表型。更重要的是，过表达sRNA RyeB能增强左氧氟沙星对泛耐菌株的抑制效果，这提示sRNA可能是影响细菌对抗菌药物的抵抗作用。抗菌药物胁迫下产生的sRNA谱可通过管理细菌的各种生理过程来调控细菌耐药。研究发现，在铜绿假单胞菌中，阿奇霉素能抑制RsmY/Z的转录，并且其对阿奇霉素的敏感性增加，这可能与铜绿假单胞菌 QS及生物膜的形成被阻断有关[32]。目前，尚无研究结果直接表明sRNA调控各种生理过程来调控细菌耐药，而这种潜在的密切联系值得进一步探究，利于为发展以sRNA为靶点的抗菌药物提供理论依据。

4 展 望

作为致病菌诸多调控网络的关键组成部分，sRNA已引起人们的关注。同时，随着生物信息学的发展，许多铜绿假单胞菌相关sRNA被发现,然而目前针对sRNA各方面的研究一直停留在表型层面，并未对sRNA的功能及其作用机制做出深入研究。今后研究者应加深对铜绿假单胞菌相关sRNA功能和作用机制的探讨，这将有助于阐明sRNA在细菌体内的精细调控作用，促使人们对sRNA分子参与的翻译调控和转录后加工产生更深的认识，最终丰富人们对细菌耐药机制的认知，以便推进抗菌治疗的发展。