急性肺损伤发病与发展相关信号通路的研究进展

杨琦 曾迎楠 许永安

浙江大学医学院附属第二医院急诊医学科 浙江大学急诊医学研究所,杭州310009

通信作者:许永安,Email:xuyongan2000@zju.edu.cn

急性肺损伤 (acute lung injury,ALI)及其最严重阶段——ARDS的发病率与致死率均较高。ALI是由于各种肺内和肺外致病因素损伤肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞,导致弥漫性肺间质及肺泡水肿,临床特点主要是进行性的低氧血症和呼吸窘迫,其严重阶段可发展至ARDS[1]。2017年,全球ICU 中,10%的ICU 患者和23%的机械通气患者发生ARDS[2]。目前尚没有发现ALI/ARDS针对性强的有效药物治疗方案,正在使用的治疗措施包括一氧化氮、表面活性剂、糖皮质激素等对症治疗措施;ARDS的病死率仍高达30%～40%[2]。目前ALI/ARDS的发病机制主要围绕炎症反应、细胞凋亡、氧化应激、组织细胞通透性改变等多种分子生物学机制进行研究。本综述将围绕ALI/ARDS的发病机制及其相关分子信号通路进行综述,为后续研究提供一定的理论基础。

1 ALI/ARDS的基本定义

最初于1967年通过病例报告对ALI/ARDS进行了定义,该报告描述了成人和儿童的急性低氧血症、非心源性肺水肿、肺顺应性降低、肺呼吸做功增加、需要正压通气[3]。ARDS的病因最常见于肺炎 (细菌性和病毒性),非肺部引起的感染 (包括腹膜、泌尿道、软组织和皮肤),胃和食道的反流物,重大创伤 (例如钝器或穿透伤或烧伤),其他相关疾病引起的包括急性胰腺炎、失血性休克或再灌注损伤 (包括体外循环和肺切除术后),因疾病关系需要红细胞和/或血小板 (即与输血相关的ALI),各种过量的药物,溺水 (吸入淡水或盐水)等[4]。1994年,初步确定了ARDS的特定诊断标准。这些标准于2012年柏林定义中进行了更新,包括: (1)发病时间。1周内出现新发或者恶化的呼吸道症状。 (2)影像学检查。X 线胸片或胸部CT上的双侧模糊影不能由积液、塌陷或结节完全解释。 (3)起源。呼吸衰竭不能由心功能或容量超负荷完全解释。(4)氧合。低氧血症的急性发作定义为氧合指数＜300 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa),呼气末正压通气≥5 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)。根据氧合指数的不同,将ARDS分为轻度 (201～300 mm Hg)、中度 (101～200 mm Hg)、重度 (≤100 mm Hg)[1]。

2 ALI/ARDS疾病进展的分期

2.1 渗出期 初始反应为渗出期,主要表现为自身免疫细胞介导的肺泡内皮和上皮屏障的破坏以及富含蛋白质的水肿液在间质和肺泡中的积累。尽管ARDS可以在缺乏中性粒细胞的情况下发生,但中性粒细胞过度炎症是ARDS肺损伤的主要损伤机制之一。ARDS的渗出期在时间上与肺毛细血管内中性粒细胞的流入、边缘化和对活化内皮的黏附有关,随后在肺泡间隙中出现多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)大量堆积[5]。活化的PMN 通过释放多种损伤因子 (包括中性粒细胞弹性蛋白酶、金属蛋白酶和其他蛋白水解酶、氧化剂和活性氮物质等)造成肺损伤[6]。除PMN 外,巨噬细胞还有趋化因子依赖性的迁移,可通过释放炎性细胞因子和凋亡诱导分子来加重肺损伤[7]。

2.2 增殖修复期 第二阶段为增殖修复期,对于宿主生存至关重要。肺泡上皮细胞再生是由肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell,AECⅡ)自身和由谱系阴性祖细胞分化而来的肺泡Ⅰ型上皮细胞 (alveolar type Ⅰepithelial cell,AECⅠ)沿裸露的基底膜扩散而完成[8]。其中,M2样肺泡巨噬细胞通过释放多种生长因子 (如角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和血管内皮生长因子)促进上皮和内皮修复[9]。

2.3 纤维化期 第三阶段为纤维化阶段,炎症反应在纤维增生期未能得到解决,导致纤维化性肺泡炎的发展、囊性变化,并通过巨噬细胞、纤维细胞、成纤维细胞和成肌纤维细胞浸润而限制了肺功能。同时释放了多种促纤维化剂,如血小板衍生生长因子、转化生长因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)等,常驻成纤维细胞分化为成肌纤维细胞,从而介导成纤维反应。

3 ALI/ARDS发病与发展相关分子信号通路

正常的肺泡上皮由AECⅠ和AECⅡ组成。AECⅠ呈鳞状,覆盖肺泡表面积的90%～95%,介导气体交换和屏障功能,容易受损伤;还具有代谢活性、参与宿主防御、肺泡重塑和抗氧化功能。AECⅡ是长方体细胞,可合成和释放表面活性剂,同时充当Ⅰ型和Ⅱ型细胞的祖细胞[10]。

各种损伤 [如高氧、脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)、博来霉素、盲肠结扎和穿刺、局部缺血/再灌注损伤和机械通气等]均可通过诱发直接或间接炎症来损伤上皮,继发性炎症损伤不可避免地会加剧这些伤害[11]。弥漫性肺泡损伤是ARDS的特征性病理表现,在电镜下表现出上皮细胞和内皮细胞的损伤。

3.1 炎症反应相关分子机制

3.1.1 丝裂原激活的蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路 MAPK 信号转导途径是真核细胞调控的普遍存在且高度进化保守的机制,存在于所有真核细胞中,对各种刺激进行协调和整合反应[12]。MAPK 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员,主要由细胞外调节蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases,ERK)、c-Jun N 端激酶和p38 MAPK 亚家族组成。在ARDS早期的肺泡炎症阶段,驻留的肺泡巨噬细胞被炎症反应激活时,MAPK 信号途径可引起促炎介质的合成和释放。在LPS诱导的ARDS模型中,细胞表面受体激活后,进一步诱导MAPK 通路中的MAPKKK、MAPKK 和MAPK 激活,从而刺激细胞对这些蛋白质进行磷酸化,并诱导调控磷酸化的基因转录以及诱导型一氧化氮合酶、环氧化酶2、肿瘤坏死因子α、IL-1β和IL-6的合成。其中ERK1/2和p38是MAPK 途径的2个重要代表成员,它们在ARDS中具有导致中性粒细胞募集的活性[13]。另外,部分研究发现,香兰素可通过减少巨噬细胞相关炎症因子和抑制ERK1/2 和p38、Akt和MAPK 以及核转录因子κB (nuclear factorκB,NF-κB)途径,对ARDS造成保护效应[14]。

3.1.2 NF-κB通路 NF-κB是体内非常经典的一条信号通路,在炎症、细胞增殖、氧化应激、细胞凋亡等过程中发挥重要的作用。NF-κB 家族主要由P65 (又称为Rel-A)、Rel-B、Rel-C、P52/P100 和P50/P105 等5 个成员组成。在正常状态下,NF-κB家族通常以同源或异源二聚体的形式与抑制κB蛋白 (inhibitoryκB,IκB)结合,形成稳定的NF-κB/IκB复合物,并以无活性的形式存在于细胞质中。最常见的由P50/P65异二聚体组成,在炎症反应中起重要作用。在经典信号通路中,NF-κB/Rel蛋白与IκB 蛋白结合并受到其抑制。LPS 刺激可激活IKK 复合体 (IKKβ、IKKα和NEMO),后者将IκB 蛋白磷酸化,活化的NF-κB形成NF-κB/Rel复合体并转运入胞核,在核内单独或联合其他转录因子调节促炎性细胞因子[15]。有研究表明:穿心莲内酯磺酸盐可抑制NF-κB的激活,从而减轻LPS诱导的肺损伤病理学变化、肺水肿和炎性细胞因子的产生,保护小鼠免受LPS 诱导的ALI,同时可抑制MAPK (p38、JNK 和ERK)和NF-κB 的 磷 酸 化[16];另 外,NF-κB 信 号通路的激活还能介导细胞凋亡。

3.1.3 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,m TOR)通路 m TOR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可在环境中通过营养素和生长因子协调真核细胞的生长和代谢,在细胞存活、增殖和代谢中起关键作用。m TOR 由2 种不同的蛋白质复合物组成:m TORC1 和m TORC2,可磷酸化Akt[17]。m TOR 异常激活在促炎性疾病的发病机理中起关键作用 (包括LPS 诱导的ALI等疾病),这使m TOR 成为这些疾病的重要治疗靶标[18]。有研究发现,在H1N1病毒感染后,m TOR 信号被激活,促进NF-κB活性和活性氧的产生,并导致NLRP3 炎性小体的激活。NLRP3 炎性小体被激活后,将IL-1β前体和IL-18前体分别裂解为成熟的IL-1β和IL-18[19],促进肺损伤。另外Couchie等[20]发现,m TORC1/p-S6K 信号转导轴在硫氧还原蛋白80 诱导的炎性体活性中起关键作用。此外,m TORC1抑制剂可以避免NLRP3炎性小体诱导的局部缺血再灌注损伤[21];引起NF-κB介导的炎性细胞因子产生的减少,导致效应T 细胞的抑制和Treg细胞的激活[22]。

3.1.4 腺苷5'-单磷酸激活蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase,AMPK)通路 AMPK 是能量稳态的主要调节器,可协调代谢途径,从而平衡营养供应与需求。由于AMPK 活化产生对代谢有利的生理结果,AMPK 被认为是控制人类疾病包括代谢综合征和癌症的重要治疗靶标。AMPK 通过激活下游效应分子SIRT1在ALI中起保护作用[23]。SIRT1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白脱乙酰基酶,具有抗炎和抗凋亡作用[24]。AMPK 具有SIRT1依赖性抗炎活性,SIRT1的激活通过降低内皮紧密连接通透性减轻了肺水肿[24]。敲低AMPK 显然会加重LPS诱导的小鼠ALI,而AMPK 激活会抑制细胞因子的产生[25]。鸢尾素上调SIRT1表达并促进AMPK 的磷酸化,通过激活AMPK/SIRT1 途径改善了上皮屏障功能障碍[26]。AMPK 可调节NLRC4炎性小体激活,AMPK 磷酸化可降低NLRC4炎性小体激活来减轻LPS诱导的ALI[27]。目前发现,AMPK 通路不仅能影响炎症反应,还能控制氧化还原状态,并维持线粒体功能。AMPK 磷酸化通过PGC-1α依赖性机制触发抗氧化剂的产生,而缺乏AMPKα的细胞显示线粒体活性氧产生的水平增加[28]。此外,AMPK 和SIRT1构成一个正反馈回路。AMPK 磷酸化通过增加SIRT1表达来增强抗氧化反应[27]。

3.1.5 PI3K/Akt通路 PI3K/Akt途径在细胞防御炎性刺激中起关键作用。PI3K 是信号转导酶的保守家族,与细胞生长、周期进入、迁移和存活的调节有关。Akt通过PI3K途径激活,其中PI3K 介导的磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸的产生导致Akt募集到细胞膜,然后通过磷酸肌醇依赖性激酶1启动Akt磷酸化[29]。研究发现,柚皮素预处理显著降低了ALI诱导的PI3K 和Akt磷酸化,这表明柚皮素预处理可以通过抑制PI3K/Akt途径来保护肺组织[30]。

3.2 氧化应激作用 过度的氧化应激会刺激肺炎性细胞活化并介导肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞的损伤,从而导致严重的肺损伤。

3.2.1 核因子相关因子2 (nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶1 (heme oxygenase-1,HO-1)通路 Nrf2/HO-1 信号通路在调节氧化应激和炎症反应中起着重要作用,并在ALI期间起着至关重要的作用[31]。作为cap-N-collar家族的成员,Nrf2被认为是主要的转录因子,可调节抗氧化反应元件介导的抗氧化酶的表达。Nrf2在诱导多种细胞保护性基因中起着重要的调节作用。其中,HO-1是Nrf2调控的基因之一,HO-1 的诱导对氧化应激具有明显的保护作用[32]。LPS可诱导Nrf2 和HO-1的激活增加,而Eph A2拮抗作用引起Nrf2和HO-1的更显著激活。Nrf2诱导剂萝卜硫素也通过抑制NF-κB通路和激活Nrf2 途径抑制炎症、抗氧化,对LPS 诱导的ARDS小鼠模型产生保护作用[33]。此外,Nrf2的转染还能够增强人类羊膜间充质干细胞在LPS诱导的小鼠ARDS模型中抑制炎症、纤维化和肺损伤的功效,通过增强Nrf2的活性并促进人类羊膜间充质干细胞分化为AECⅡ[34]。

3.2.2 Janus激酶 (Janus kinase,JAK)/信号转导子和转 录 激 活 子 (signal transducers and activators of transcription,STAT)通路 JAK/STAT 通路对于细胞因子受体的信号传导至关重要,并且对血液形成和免疫反应至关重要[35]。氧化应激还介导了JAK 的不适当激活,继而激活了转录因子STAT3,其异常激活与炎症和致癌作用有关。静脉内注射硅纳米颗粒可以在体内引起氧化应激,介导JAK/STAT3 途径的激活,从而引起肺部和全身炎症[36]。

3.3 细胞凋亡

3.3.1 PI3K/Akt通路 细胞内的凋亡信号通路是由线粒体激活介导的细胞色素C 和细胞凋亡诱导因子的释放、胱天蛋白酶激活、介导线粒体调控细胞凋亡,这些均受BCL2蛋白质家族成员的调节[37]。PI3K/Akt信号通路可以调节BCL2家族成员的活性介导细胞凋亡。有研究发现Genipin通过PI3K/Akt信号通路下调BCL2,介导胱天蛋白酶激活和细胞色素C释放来抑制LPS诱导的线粒体依赖性凋亡信号[38]。在LPS引起ALI小鼠中,低分子透明质酸通过上调抗凋亡蛋白Mcl-1 的表达来激活PI3K/Akt信号传导,从而延迟了肺中性粒细胞的凋亡[39]。

3.3.2 Fas/Fas L 通路 Fas/Fas L 通路的激活也是导致ARDS患者肺泡上皮凋亡的重要机制[40]。FasL是一种Ⅱ型跨膜蛋白,有280个氨基酸 (糖基化后相对分子质量大约为40 000),属于肿瘤坏死因子家族。Fas 与其配体FasL的结合会诱导一个凋亡通路激活,形成死亡诱导信号转导复合体,同时募集接头蛋白FADD 和caspase-8。在这个复合体中,caspase-8 的激活会引发半胱天冬酶级联反应,从而引起caspase-3激活、蛋白裂解,最终导致细胞凋亡[41]。Fas/FasL系统的激活会通过涉及caspase介导的肺泡壁凋亡的机制,增加小鼠肺泡-毛细血管蛋白的通透性并损害肺泡液的清除,导致肺水肿的形成[42]。

3.4 肺泡-毛细血管通透性改变 内皮细胞作为血管内皮的基本结构和功能单位,其重要功能之一就是发挥其屏障功能,与细胞外基质一起构成完整的内皮细胞屏障,调节血管内外物质的交换,从而维持内部环境的稳定性,使组织器官远离破坏。血管内皮屏障的完整性取决于细胞附着和肌球蛋白的收缩性[43]。在病理条件下,细胞连接的破坏促进了细胞间裂缝的形成。因此,细胞间连接和受损的细胞间连接的综合作用是增加血管通透性的重要原因。

Rho A/ROCK 途径是Ras 同源基因家族,成员A(Rho A)及其下游效应子ROCK 在多个细胞生长发育及代谢过程中起重要作用;该途径的异常激活涉及多种类型的疾病[44]。目前已确定Rho家族的23个成员,包括Rho A、Rac和Cdc42[45]。Rho/ROCK 伴随着ALI的整个炎症反应过程。小GTP结合蛋白Rho A 及其下游靶标ROCK 通过控制细胞收缩和肌动蛋白-细胞骨架装配来调节细胞增殖、黏附和迁移。众所周知,Rho A/ROCK 途径的异常激活可通过平衡血管收缩和血管舒张物质的产生来提高血管张力[46]。因此,在多种病理情况下,抑制Rho A/ROCK 途径均可降低血管通透性。Eph A2拮抗作用可以明显抑制LPS诱导的肺组织Rho A 和ROCK 活化,降低肺血管通透性的增加[47]。

3.5 纤维化修复 在肺组织修复过程中,成纤维细胞被分化为成肌纤维细胞,其特征在于α-平滑肌肌动蛋白从头表达,主要负责细胞外基质成分的生产,包括胶原蛋白、纤连蛋白等。

3.5.1 Wnt信号通路 Wnt信号通路包含一系列高度进化保守的分泌糖蛋白,也是成年哺乳动物中大多数类型的组织干细胞的关键驱动因素,可触发多种信号通路来控制细胞增殖、分化和迁移等过程。Wnt/β-catenin信号通路在配体、细胞质和核内转录因子水平与TGF-β1/Smads信号通路相互作用。在TGF-β1诱导的正常成纤维细胞向成肌纤维细胞的分化过程中,Smad2、Smad3 和β-catenin的蛋白表达显著上调[48]。Wnt抑制剂抑制Wnt和β-catenin蛋白的表达,下调ALI诱导的细胞增殖和凋亡的功能[49]。当肺泡壁破坏与细胞外基质沉积相关的异常修复过程时,Wnt通路激活,AECⅡ中核转录因子β-catenin 的表达可能降低[50]。还有研究观察到硅纳米颗粒处理的小鼠肺中TGF-β和p-Smad3的蛋白表达上调,而STAT3和IL-6的蛋白表达升高促进了TGF-β的产生,从而促进了从成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化,加速了肺部胶原蛋白的产生。此外,研究还发现氧化应激和炎症通过激活JAK2/STAT3和TGF-β/Smad3信号传导途径促进了胶原蛋白的产生[36]。

3.5.2 Notch信号通路 在肺发育和再生过程中,Notch信号传导在调节细胞命运的确定、增殖和分化中起着至关重要的作用[51]。哺乳动物中的Notch信号通过4种受体亚型,即Notch 1-4,被标准配体Dll1、3、4 和Jagged 1、2激活[52]。在肺生成过程中,Notch信号介导肺内的神经内分泌、纤毛细胞的分化及AECⅠ和AECⅡ的生成[53]。在成人中,Notch参与多种气道细胞类型的修复和再生。另外,Wnt和β-catenin在损伤后也可在AECⅡ中活化并调节AECⅡ祖细胞功能[54]。最近的研究表明,β-catenin功能获得性突变导致稳态期间AECⅡ向AECⅠ过渡的停止[55]。在AECⅡ祖细胞功能调节中Wnt和Notch信号之间存在相互作用。目前发现Notch信号通路上的非经典Dlk1配体对于铜绿假单胞菌诱导的损伤后AT2到AT1的转变和肺泡上皮的修复是必需的[56]。

4 小结

ALI/ARDS作为临床治疗过程中常见的呼吸系统急重症,是一种过度反应的急性炎症,通过各种信号通路、分子机制导致肺功能障碍、肺内皮和上皮损害以及继发产生的化学物质对肺组织造成二次破坏。目前仍然缺乏可以增加ALI/ARDS患者生存率的有效药物疗法。但是,目前围绕ALI/ARDS的发病机制以及治疗效果开展了多种信号通路研究,研究中发现,药物、化学衍生物或细胞治疗等多种治疗方式均会通过不同的分子机制作用于肺组织,协助肺损伤修复。在各种肺损伤的发病机制中,部分信号通路对肺损伤的产生有促进作用,部分信号通路具有肺保护效应,而信号通路间也存在着相互作用。本综述主要通过介绍ALI/ARDS的不同发展阶段、多种损伤及修复的病理表现,对多种信号通路介导的ALI及修复再生的作用机制进行深入研究,对造成肺损伤的相关通路的正反馈和/或负反馈机制进行了解,从而着重于减轻肺组织损伤,甚至逆转肺损伤,为未来治疗ALI提供了一条途径。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突