PCR检测HBV前C/C基因启动子区变异与肝细胞癌的关系

李彦伟

肝细胞癌(HCC)以中低分化程度为主，5年生存率7%至38%，预后较差[1]。而乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC的重要诱因，其中HBV前C/C基因启动子区变异与HCC等病变密切相关[2]，但临床对其引发HCC的具体机制尚不明确。本文纳入35例HCC和35例HBV携带者，对比分析HBV前C/C基因启动子区变异特点，探讨其在HCC病变中的作用，报道如下。

资料与方法

一、 一般资料

纳入本院35例HCC与35例HBV感染携带者作为研究对象。HCC设为观察组，男、女分别22、13例；年龄18～65岁，平均(48.28±13.19)岁；BMI 17.5～23.0 kg/m2，平均(20.44±2.20)kg/m2；HBeAg阳性6例。HBV携带者为对照组，男、女分别19、16例；年龄18～65岁，平均(47.56±14.24)岁；BMI 18.0～23.5 kg/m2，平均(20.96±1.87)kg/m2；HBeAg阳性7例。两组患者基本资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

二、 纳入与排除标准

(一) 纳入标准：(1)本研究纳入HCC与HBV携带患者诊断标准分别参照指南和防治方案进行[3-4]；(2)入选患者均行HBV前C/C基因启动子区检测。

(二)排除标准：(1)合并酒精性脂肪肝和代谢性肝病患者；(2)合并有严重心脑血管疾病及甲状腺功能异常者；(3)合并有恶性肿瘤者；(4)PCR扩增不成功者；(5)病历资料不全者。

三、 检测方法

(一) 实验设备试剂：PCR扩增仪为美国赛默飞SimpliAmpTM热循环仪梯度PCR仪，基因测序仪为NexSeqCN500基因测序仪，由杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司提供。Taq DNA多聚酶和DNA纯化试剂盒购自北京奥维亚生物技术有限公司。参照GenBank HBV基因型保守序列进行引物设计，引物为PreS2(5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAA-3′，2794-2814)和Pol10A(5′-GCAGCAAAGCCCAAAA-GACC-3′)。

(二) PCR扩增：以巢式PCR扩增检测HBV前C/C基因，严格按试剂盒说明方法进行。抽取血清HBV DNA，后PCR扩增，94 ℃预变性2 min → 94 ℃变性30 s → 55 ℃退火30 s → 72 ℃延伸90 s → 35个循环 → 72 ℃延伸5 min。后进行产物纯化及测序。用Seq Man软件进行变异分析，与Gen Bank HBV相应基因序列进行对比记录。

(三)HBV分型：用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳处理，依据切片长度确定基因分型。

四、统计学方法

以SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料以±标准差表示，行t检验，计数资料以百分比表示，行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 PCR扩增结果

观察组HBV前C/C子区24例发生变异，其中G1896 17例，G1899 7例，对照组HBV 前C/C子区7例，其中G1896 2例，G1899 5例，两组HBV前C/C子区变异率差异有统计学意义(χ2= 19.586，P=0.000)。

二、 基因型分布结果

观察组HBV前C/C基因启动子区基因亚型中Ba型7例，C1亚型16例，C2亚型12例，对照组Ba型4例，C1亚型17例，C2亚型14例。两组基因型分布无显著性差异(χ2= 1.002，P=0.606)。

讨 论

HBV感染可导致慢性肝炎的持续性进展和肝细胞异常增殖分化，成为癌变的潜在危险因素。另外，HBV感染后宿主免疫抵抗力下降，使HBV发生变异，这可使病毒避免免疫攻击，为病毒复制创造条件，最终破坏宿主基因组，发生癌变。既往报道认为HBV前C/C基因启动子区突变是肝功能恶化，HBV复制活跃的信号[5]，施海燕等[6]一项报道则指出HBV前C/C变异是加快慢性乙型肝炎患者肝纤维化病理变化的高危因素。

本研究显示两组HBV前C/C基因启动子区变异率差异显著，其中HCC患者以G1896变异为主，这可能是因前C/C基因启动子区1896位核苷酸变异可使HBV逃过宿主免疫识别，破坏宿主原有基因组的平衡状态，降低了患者对HBV感染的耐受性，使宿主肝细胞更易发生炎症坏死，增加癌变风险。另外，G1896位点变异还可使HBeAg翻译提前终止，进而发生HBeAg转换，影响疾病进展。

另外，本研究还显示HBV前C/C基因启动子区亚型分布差异无统计学意义，这提示HCC的发生可能与HBV前C/C基因型并无显著关系。可能是因HBV前C/C基因启动子突变多发生于C亚型，而HCC患者亚型亦以C亚型为主。另外，本研究样本量小，有报道还显示HCC基因型分布与年龄、地域等因素有关[7]。因而，有关基因型分布与HCC的关系还有待今后扩大样本量进行多因素分析观察。