阴道微环境与人乳头瘤病毒感染相关性的研究进展

王嫱，郭洁，宋殿荣

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是威胁女性健康的性传播感染，随着社会经济的发展，人们性观念逐渐开放，其发病率有所上升。据估计，细胞学正常的女性中HPV感染的全球流行率为11.7%[1]，而中国性活跃的女性HPV感染率为14.3%[2]，并且HPV感染在25岁以下的女性中达到高峰，在55岁或更大的年龄时再次达到高峰[3]。此外，99.7%的宫颈癌中都能发现高危型HPV感染[4]。但单独HPV感染不足以使上皮细胞直接恶变，还需要其他因素的协同或促进。目前的研究表明HPV感染的转归与宿主和病毒的自身因素以及阴道微环境的平衡状态有关[5]。因此，现就阴道微环境与HPV感染的相关性进行综述。

1 HPV的特性

HPV为乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒A属，其病毒颗粒由直径约为60 nm的20面体衣壳组成，包裹在衣壳蛋白内的是含有8 000个碱基对的双链HPV DNA。基因组中含有3个功能性编码区，约10个开放阅读框（ORF）：早期蛋白编码区（E）包括E1、E2、E4、E5、E6、E7 和 E8，与 DNA 复制、转录调节和细胞转化等有关；晚期蛋白编码区（L）包括L1和L2基因；长控制区域（LCR）、上游调节区域（URR）或非编码区域（NCR）含有DNA复制起点，主要调控病毒DNA的转录和复制。

HPV是一类显示高度的宿主特异性和亲和力的无包膜小型双链环状DNA病毒，主要侵犯人体皮肤和黏膜的基底上皮细胞。目前感染黏膜上皮的HPV类型大约40个，依据HPV不同型别与肿瘤发生的危险性高低分为高危型和低危型。高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68等亚型，与大多数宫颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、口咽癌以及癌前病变有关；低危型HPV包括HPV 6、11、42和43等亚型，主要与尖锐湿疣等良性病变有关。HPV主要感染鳞状细胞中的基底层细胞以及鳞柱交界处的上皮细胞和化生细胞。高危型HPV感染鳞状细胞中的基底层细胞并且感染持续一段时间后导致HPV-DNA与人体DNA整合，使局部鳞状上皮细胞异常增殖，是引发宫颈癌的根本原因[6]。HPV感染具有组织趋向性，Monroy等[7]的研究表明HPV16易于感染鳞状上皮细胞，从而导致宫颈鳞癌；HPV18倾向于感染宫颈腺体组织，可导致宫颈腺癌的发生。

HPV感染的主要途径是性传播，还包括垂直传播和密切接触传播[8]。HPV通过性行为等产生的微小损伤感染组织，在主要蛋白（L1）和次要蛋白（L2）协助下内化进入细胞，脱壳成功后进入细胞质并开始转录，首先以低拷贝水平游离于基底和副基底细胞中，此时病毒处于潜伏状态。在上皮细胞分化后，病毒复制到高拷贝水平并且表达衣壳蛋白（L1、L2），HPV E6、E7分别通过结合抑癌蛋白p53、视网膜母细胞瘤（pRB），诱导细胞不断增殖、分化，使细胞周期失控，基因组不稳定。当中层和表层细胞中病毒拷贝到一定数量，基因复制完成并产生病毒性颗粒，装配完成后释放到细胞外，进而感染其他细胞。

2 阴道微环境

阴道解剖结构、微生物菌群、局部免疫及机体的内分泌调节功能共同构成了阴道微环境。阴道位于膀胱、尿道和直肠之间，其上端包绕宫颈阴道部，并与宫颈阴道部之间形成阴道穹，下端开口于阴道前庭后部。阴道壁自内向外由黏膜、肌层和纤维组织膜构成。黏膜层由非角化复层鳞状上皮覆盖，无腺体，有许多横行皱襞，受性激素影响有周期性变化。健康女性阴道菌群分布于阴道黏膜层，是由多种厌氧菌和需氧菌构成，且两者的比例为5∶1。我国健康育龄女性阴道常见的乳杆菌为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）和詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii）。

Di Paola等[9]分别对55例HPV阳性和17例HPV阴性的女性宫颈阴道分泌物进行16S核糖体RNA基因的焦磷酸测序，确定了4个主要微生物群落（community state types，CST）：CST Ⅰ以卷曲乳杆菌为主；CSTⅡ以加氏乳杆菌为主；CSTⅢ以惰性乳杆菌为主；CSTⅣ以乳杆菌含量低于60%，且以大量绝对或兼性厌氧菌（加德纳菌属、普氏菌属、阿托波氏菌等）为主。

女性阴道是一个开放性腔道，极易受到外界和内部因素干扰。一旦阴道微生态系统的平衡遭到破坏，就会引起内源性、外源性微生物入侵，进而导致各种生殖道感染性疾病的发生。如由于阴道内能产生过氧化氢的乳杆菌减少，阴道加德纳菌、普雷沃菌等厌氧菌增多，阴道pH值增加，导致细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）的发生。

3 阴道微环境与HPV感染的关系

3.1 菌群及其代谢物与HPV感染的关系

3.1.1 优势菌与HPV的关系 女性阴道微环境中含有多种微生物，其中以革兰阳性乳杆菌为优势菌。乳杆菌的主要功能包括：降低阴道pH，维持酸性环境；形成保护性菌膜，抑制病原微生物，以及激活免疫系统产生免疫应答以清除病毒[10]。乳杆菌吸附、定植于阴道上皮细胞，通过分解阴道表层上皮细胞分泌的糖原来获取营养物质与能量，并产生乳酸和过氧化氢（H2O2）来维持阴道的酸性环境。乳杆菌黏附在阴道黏膜表面形成生物膜，防止致病微生物的黏附与异常增殖，其产生的乳酸能杀灭致病微生物与病毒，防止内源性致病菌异常增殖、外源性致病菌侵入以及性传播疾病的发生[11]。阴道微环境紊乱，阴道内乳杆菌的优势地位发生变化，则会导致致病微生物的入侵。Brotman等[12]对32例育龄女性进行每周2次为期16周的阴道拭子采集并进行HPV检测，结果发现以加氏乳杆菌为优势菌的阴道菌群能增加HPV的清除率。Dareng等[13]的研究显示，在人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）阴性的妇女中高危型HPV感染与乳杆菌减少伴厌氧菌（尤其是普氏菌属和纤毛菌属）增加有关。另有学者通过比较HPV阴性组、HPV清除组和HPV持续感染组阴道菌群的丰度和多样性，发现约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）在HPV持续感染组的比例增加，这表明约氏乳杆菌与HPV持续感染有关[14]。Reimers等[15]的研究发现，在HIV阴性和HIV阳性伴CD4+T细胞＞500 cells/mm3和HIV阳性免疫抑制的妇女中，HPV检出率低与卷曲乳杆菌的相对丰度高有关，且不依赖于pH。因此，阴道内不同种类的乳杆菌对HPV感染的影响不同，卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌会降低HPV的感染，而约氏乳杆菌会促进HPV感染。

乳杆菌的代谢产物能激活免疫系统。乳杆菌产生的主要有机酸代谢产物乳酸的抗炎作用由pH≤3.86的质子化形式介导，有研究将乳酸的pH调节至3.9并直接作用于阴道上皮细胞和宫颈上皮细胞系，发现抗炎因子白细胞介素1（IL-1）受体拮抗剂（IL-1RA）的产生显著增加[16]。此外，L-乳酸和D-乳酸还可通过抑制Toll样受体激动剂，减少促炎因子IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、T细胞激活性低分泌因子（RANTES）、IL-8和巨噬细胞炎性蛋白 3ɑ（MIP3ɑ）的产生，从而保护生殖道上皮细胞免受炎症刺激[16]。这说明乳杆菌可通过免疫调节介导乳酸对生殖道上皮细胞的抗炎状态，并保护其免受HPV的入侵[16]。

乳杆菌可以抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移。Wang等[17]研究发现卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌和加氏乳杆菌的上清液通过调节HPV16 E6和E7致癌基因以及与细胞周期相关的基因来抑制宫颈癌细胞的生长。卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌的上清液对宫颈癌Hela细胞有细胞毒性，且不依赖pH和乳酸[18]。另有研究将活化的乳杆菌作用宫颈癌HeLa和U14细胞24、48 h后显著抑制了宫颈癌细胞的迁移能力；当荷瘤小鼠腹腔注射活化的乳杆菌后，肿瘤质量和体积均减小（P＜0.01），并检测到具有维持细胞间黏附、上皮组织极性和结构完整性的E-钙黏蛋白表达升高，这可能是乳杆菌抑制宫颈癌细胞迁移的作用机制[19]。

乳杆菌可以抑制宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasias，CIN）的发生发展。Oh 等[20]对70例CIN女性和50例对照女性的宫颈微生物进行了分析，发现当阴道呈现以阴道阿托波氏菌、阴道加德纳菌以及惰性乳杆菌为优势菌，卷曲乳杆菌减少为特征微环境时，患CIN的风险将增加。

3.1.2 菌群多样性与HPV的关系 在人体口腔、胃肠道等其他部位，微生物菌群多样性、丰度高被认为是健康的表现，而正常阴道微生物菌群是仅以少数几种乳杆菌为优势菌，多样性和丰度均较低。若阴道内菌群多样性增加，则会引起阴道微环境失衡，增加HPV易感性。HPV感染与菌群变化会导致HPV持续感染、阴道微环境失调以及致瘤性环境形成。此外，宫颈病变的发展与阴道微生物群高度多样性有关[21]。CIN级别的升高与阴道微生态菌群多样性呈正相关[22]，与乳杆菌的相对丰度呈负相关。Lam等[23]通过对晚期鳞癌患者的标本进行微生物组分析，发现最多的微生物是芽孢杆菌科、盐杆菌科和普雷沃氏菌科，将二路普雷沃菌与宫颈癌HeLa细胞系进行培养发现其在促炎途径中上调了3种基因，分别是溶酶体相关膜蛋白3（LAMP3）、信号传导及转录激活蛋白 1（STAT1）和多肽转运体基因 1（TAP1），推测肿瘤内微生物群可能通过诱导免疫反应驱动因子来促进宫颈癌的发生。

研究表明核心微生物群落组成的变化可能与HPV感染有关[24]。一项横断面研究显示，HPV感染的女性比正常女性阴道加德纳菌和阿托波氏菌的检出率更高。同时，HPV感染者的阴道菌群多样性和组成比HPV阴性者更复杂[25]。有学者对上海郊区3 502例女性进行HPV和BV感染情况的调查，发现与HPV阴性组比，HPV阳性组中BV的发生率更高（15.5%vs.3.1%，P＜0.001）；与BV阴性组比，BV阳性组中HPV 感染居多（83.3%vs.46.2%，P＜0.001），而且宫颈病变主要发生在HPV和/或BV感染者中，这表明HPV和BV协同作用于宫颈，可能会增加宫颈病变发生的风险[26]。因此，重视女性阴道微生物群的特征变化可能有助于降低HPV感染或持续感染的风险。

3.2 pH与HPV的关系 正常阴道的酸性环境是维持阴道微环境稳态的首要机制，这决定了阴道内寄生的细菌一般都呈嗜酸性或耐酸，并且抑制HPV的入侵。正常阴道的pH值通过维持细菌素和H2O2的活性，可增强阴道微环境对HPV的抵抗力。有研究将100例绝经前妇女分成HPV阴性对照、HPV阳性对照、低度不典型增生（LGD，即CIN 1）、高度异型增生（HGD，即 CIN2/3）和浸润性宫颈癌（ICC）组，其中阴道pH值异常（＞4.5）的女性所占比例分别为55%、78%、73%、93%、100%（P=0.003）[27]，这表明 pH值与宫颈病变严重程度有关。Clarke等[28]评估了9 165例18～97岁的女性阴道pH与HPV感染及相关的细胞学异常间的关系，发现HPV感染与阴道pH（4.0～5.5）主要在＜35岁的女性中呈正相关，在＞35岁的女性中没有相关性；并且在35岁以下和65岁以上的女性中发现阴道pH升高（≥5.0）会增加30%的多种HPV基因型感染以及低度鳞状上皮内病变（LSIL）感染的风险，这一结果也表明不同年龄女性阴道PH改变可能会提高HPV感染率。

3.3 局部免疫与HPV感染的关系 健康完整的阴道黏膜是阻止致病菌入侵机体的第一道免疫防线，其表面是免疫和物理屏障，可防止潜在的病原体与阴道上皮细胞接触。阴道局部免疫的作用包括从感染的病灶中清除微生物，并且产生抗微生物的中和抗体，以及涉及结合先天和后天黏膜反应的动态免疫网络。参与先天免疫的细胞包括自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜酸性粒细胞等。适应性免疫是T细胞呈递和抗原呈递细胞（APC）或B细胞抗体分泌刺激后的病原体特异性应答。这种免疫应答由APC驱动，包括巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞及子宫颈和子宫内膜的上皮细胞，其效应组分是CD4+T细胞以及其分泌的细胞因子、CD8+T细胞（细胞毒性效应细胞）和免疫球蛋白[29]。

接触HPV后，正常阴道菌群会激活巨噬细胞、NK细胞等多种免疫细胞，诱导产生TNF-2、IL-12、NO等效应因子以清除病毒[10]。但由于全身抗原特异性T细胞反应很弱而且往往是短暂的，所以HPV感染后不能在机体引起强烈的免疫反应，故多呈潜伏感染，没有任何临床症状。HR-HPV E6和E7蛋白破坏角质形成细胞的炎症反应导致宿主免疫应答的无效性[30]，导致阴道局部免疫细胞功能和免疫因子表达失调，机体自身免疫和局部免疫功能破坏，这不仅增加HPV易感性，也降低了免疫系统对于HPV自然消除的速率。随着HPV持续感染，宫颈病变的程度逐渐加重，又会导致局部免疫力下降[31]。

Gao等[25]对100例绝经前非妊娠的女性阴道灌洗液中21种免疫介质进行检测，发现不论是否以乳杆菌为优势菌的阴道微环境，IL-36γ是唯一与宫颈癌呈正相关的细胞因子。这表明IL-36γ是微生物入侵后上皮细胞和免疫激活的驱动因素，可能在宿主防御入侵的病原体中发挥关键作用。另有学者利用细菌和病毒产物（鞭毛蛋白、FSL-1、聚乙二醇（I∶C）处理人类3-D阴道和宫颈上皮细胞，结果发现在上皮细胞中表达和分泌的IL-36γ通过诱导促炎细胞因子（IL-1B、IL-6、CCL20 和 TNFα）、趋化因子的产生来刺激先天免疫反应，从而促进黏膜炎症反应发生，这也表明当微生物入侵后IL-36γ的分泌增加在宿主防御HPV感染及宫颈病变发生发展中发挥关键作用[32]。

有研究将117例HR-HPV感染患者分为无宫颈鳞状上皮内病变（NSIL）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）和高度鳞状上皮内病变（HSIL）组，分别测量阴道灌洗液中 IL-6、IL-2、IL-4、IL-17A、IL-10、TNF和γ干扰素（IFN-γ）的水平，并计算IL-6和IL-2的细胞因子评分，发现疾病严重程度与IL-6水平呈正相关，与IL-2水平呈负相关，且细胞因子评分高的HPV阳性患者在3年内发生HSIL的风险增加[33]。这项研究在一定程度上反映出细胞因子在预测宫颈病变中的作用，而细胞因子评分是否能作为预测宫颈病变进展的指标还需更多临床和基础研究的证实。

Shannon等[34]对59例女性的宫颈脱落细胞进行HPV检测并于6个月后重复HPV检测，发现HPV清除者比HPV阴性和持续HPV感染者的朗格汉斯细胞数目增多（P=0.015），这表明HPV的清除与朗格汉斯细胞数目增多有关。其机制可能是朗格汉斯细胞直接识别表皮细胞中的HPV蛋白，且随着朗格汉斯细胞数目增多，朗格汉斯细胞上表达的E钙黏蛋白增多，促进HPV清除。因此保持局部免疫细胞与免疫因子的正常功能有助于抑制HPV感染，防止宫颈病变的发生。

3.4 雌孕激素波动与HPV感染的关系 阴道微环境是一个复杂而动态的系统，随女性性成熟阶段的不同而发生变化。在女性整个育龄期，阴道微生物成分的波动与月经周期中雌激素和孕激素的周期性分泌有关。更年期女性由于体内雌激素水平下降，阴道萎缩导致了乳杆菌耗尽，进而增加了HPV的易感性。育龄期女性在高雌激素状态下促进阴道上皮细胞的成熟、增殖以及糖原的积累。糖原被人α淀粉酶分解代谢并转化为较小的聚合物，即麦芽糖、麦芽三糖和α糊精，然后作为乳杆菌的营养支持最终代谢为乳酸，从而使阴道处于pH为3.5～4.5的微环境中以保护女性生殖道免于HPV感染。孕激素不仅能降低乳杆菌的数量及阴道清洁度，还直接抑制T细胞分化为Th1，增强Th2的表达，降低阴道局部免疫力，使阴道微环境易于被病原微生物破坏。

雌激素通过上调HPV致癌基因的表达来促进肿瘤的生长和持续。Park等[35]研究发现持续的雌激素诱导转基因小鼠的宫颈鳞柱交界细胞和阴道上皮细胞增殖，激活HPV18 E6、E7表达，促进宫颈病变的发生。另有研究比较了宫颈鳞癌和正常女性中HPV16与体内雌激素变化，发现异常高水平的内源性雌二醇（＞40 pg/mL）可能进一步增加HPV16型感染者进展为宫颈癌的风险[36]，其原因为HPV16-E7和雌二醇负调节颗粒酶B（GrB）的表达和活性，并增加角质形成细胞中丝氨酸蛋白酶抑制剂（protease inhibitor-9，PI-9）的表达，使癌前细胞获得细胞毒性，并有助于癌细胞的免疫逃避[37]。

雌孕激素波动可以通过影响阴道微环境中乳杆菌的功能和数量，从而改变机体对HPV易感性；还可通过刺激HPV基因表达，以及降低阴道局部免疫等方式，促进宫颈病变的发生发展。因此，随着女性生理阶段的变化，机体对HPV的易感性存在变化。

4 结语

正常的阴道微环境是抵御HPV感染的第一道防线。阴道微环境发生变化或失衡一方面可引发宫颈黏膜损伤、局部免疫异常，给HPV感染可乘之机，另一方面其在HPV持续感染和宫颈病变进展中亦起到推波助澜的作用。同时，HPV感染也可能诱导阴道微环境失衡，两者相互影响，互为因果。可见，维持阴道微环境的平衡有助于降低HPV感染及宫颈病变的发生，从而保护女性生殖健康。因此，探讨阴道微环境变化与宫颈HPV感染的关系，及其在宫颈病变发生中的作用对预防和治疗宫颈癌前病变及宫颈癌有非常重要的研究意义和临床价值。今后应结合女性生理阶段及对生育的要求，针对不同阴道微生态失衡状态开展相关基础和临床研究，实施分层、长期管理，同时积极探索预防及降低HPV感染的新途径，从根本上预防宫颈癌。