芪蓟肾康汤对转基因免疫球蛋白A肾病小鼠转化生长因子β1/Smads信号转导通路的调控机制研究※

张天舒 吕 静 丁晓欢 栾 佳

(辽宁中医药大学2018级硕士研究生，辽宁 沈阳 110847)

免疫球蛋白A(IgA)肾病是以肾小球系膜区IgA沉积为特征的免疫复合物肾小球肾炎，临床可见肉眼血尿或镜下血尿，可伴有不同程度蛋白尿，随着病情的进展可出现肾小球硬化[1]。因此，对于IgA肾病尽早发现并积极治疗具有重要意义。芪蓟肾康汤是我们临床治疗IgA肾病的经验方，先前研究已经表明芪蓟肾康汤对IgA肾病模型大鼠具有确切的治疗作用，并可通过抑制白细胞介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达抑制炎性反应,最终起到防治肾小球硬化的目的[2-3]。为进一步探讨芪蓟肾康汤治疗IgA肾病的作用机制，我们拟通过观察其对转基因IgA肾病小鼠转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads信号转导通路的影响进行探讨，结果如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级IgHA1-mut转基因F1代小鼠120只，雌雄各半，12周龄，体质量22 g，由中国医学科学院医学实验动物研究所制作IgHA1-mut转基因F0亲代小鼠[SCXK(京)2011-0022]，并于辽宁中医药大学实验动物中心保种、繁育并鉴定为IgHA1-mut基因型阳性的F1代小鼠[4]。C57BL/6J小鼠24只，雌雄各半，12周龄，体质量22 g，北京市维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证SCXK(京)2013-0002。

1.2 实验药品 芪蓟肾康汤(药物组成：黄芪25 g，丹参20 g，牡丹皮15 g，仙鹤草15 g，重楼15 g，白花蛇舌草20 g，老头草20g，小蓟25 g。由辽宁中医药大学附属医院药剂科负责加工并制成汤剂。)；替米沙坦片(上海勃林格殷格翰药业有限公司，国药准字J20150084)。

1.3 实验试剂及仪器

1.3.1 主要试剂 DRR047A含gDNA的定量反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(日本Takara公司)；一抗：兔抗小鼠Smad2与兔抗小鼠TGF-β1(美国Cell Signaling Technology公司)、兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(英国Abcam公司)；二抗:辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.3.2 主要仪器 Stratagene Mx3000P型实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测仪 (德国Agilent公司)；DU640型蛋白核酸分析仪(美国Backman公司)；MR1822型低温高速离心机(法国Jouan公司)；DYY-12型多功能电泳仪、DYCP-40C型半干式碳板转印电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及给药 全部小鼠适应性喂养3 d。然后随机取8只C57BL/6J小鼠作为空白组，再取IgHA1-mut转基因F1代小鼠40只，分为模型组、西药组、芪蓟肾康汤低剂量组、芪蓟肾康汤中剂量组及芪蓟肾康汤高剂量组，每组8只。空白组及模型组按2 mL/100 g予0.9%氯化钠注射液灌胃，西药组按2 mg/100 g予替米沙坦药液灌胃，芪蓟肾康汤低、中、高剂量组分别按0.6、1.2、2.4 g生药/100 g灌胃，每日1次，连续灌胃28 d。

1.4.2 标本采集 各组小鼠均在灌胃14、21、28 d后随机取2只小鼠，腹腔麻醉，迅速打开腹腔，摘取肾组织，0.9%氯化钠注射液冲洗后，部分以4%多聚甲醛固定之后保存备用，剩余部分液氮冷冻保存备用。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 肾组织Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表达 采用Real-time PCR法检测。在液氮中取50～100 mg肾组织，放入研钵反复研磨3次，加入Trizol裂解细胞，抽取肾组织细胞的总RNA。将得到的总RNA样本根据37 ℃，15 min，85 ℃，5 s条件，使用DRR047A含gDNA的定量反转录试剂盒进行逆转录反应以得到对应的cDNA。逆转录产物cDNA 4 ℃保存备用。后在Real-time PCR仪上按照如下反应条件进行扩增反应：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火1 min后采集荧光信号，重复40个循环。反应体系：2×SYBR Green qPCR预混液(10 μL)，无酶无菌水(7 μL)，对照荧光染料(0.3 μL)，上游引物(2 μL)，下游引物(2 μL)，cDNA(2 μL)，Total(23.3 μL)。使用Primer-BLAST[5]设计引物，以GAPDH作内参照。采用2-△△CT法分析样品mRNA的相对表达量。Smad3:上游引物序列5'-AGAAGCTCAAGAAGACGGGG-3'，下游引物序列5'-CAGTGACCTGGGGATGGTAA-3'。Smad7：上游引物序列5'-CAAACCAACTGCAGGCTGTC-3'，下游引物序列5'-CCCCAGGGGCCAGATAATTC-3'。GAPDH：上游引物序列5'-CCCTTAAGAGGGATGCTGCC-3'，下游引物序列5'-TACGGCCAAATCCGTTCACA-3'。

1.5.2 肾组织TGF-β1及Smad 2蛋白表达 采用蛋白质免疫印迹法检测。将剩余肾组织采用剪碎法制作肾组织匀浆[6]，先测各个细胞样本蛋白含量(用考马斯亮蓝法[7])，再进行分离、凝固、加样、蛋白电泳转移、一抗及二抗反应、透膜、曝光、洗片，最后采用Scion Image软件分析相对灰度值。

2 结 果

2.1 各组小鼠灌胃14、21、28 d后肾组织Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表达水平比较 见表1。

由表1可见，与空白组灌胃后同期比较，模型组灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)，Smad7 mRNA表达水平均明显降低(P<0.05)。与模型组灌胃后同期比较，西药组及芪蓟肾康汤中、高剂量组灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表达水平均明显降低(P<0.05)，Smad7 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)，芪蓟肾康汤低剂量组仅灌胃28 d后Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表达水平与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。芪蓟肾康汤各剂量组组间比较，芪蓟肾康汤中、高剂量组灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表达水平均明显低于芪蓟肾康汤低剂量组(P<0.05)，Smad7 mRNA表达水平均高于芪蓟肾康汤低剂量组(P<0.05)，且芪蓟肾康汤高剂量组灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表达水平改善优于芪蓟肾康汤中剂量组同期(P<0.05)。

表1 各组小鼠灌胃14、21、28 d后肾组织Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表达水平比较

2.2 各组小鼠灌胃14、21、28 d后肾组织TGF-β1及Smad2蛋白表达比较 见表2、图1。

表2 各组小鼠灌胃14、21、28 d后肾组织TGF-β1及Smad2蛋白表达比较

由表2可见，与空白组灌胃后同期比较，模型组灌胃14、21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与模型组灌胃后同期比较，西药组及芪蓟肾康汤中、高剂量组灌胃14、21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，芪蓟肾康汤低剂量组仅灌胃21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.05)。芪蓟肾康汤各剂量组组间灌胃后同期比较，芪蓟肾康汤中、高剂量组灌胃14、21、28 d后TGF-β1蛋白表达水平均明显低于芪蓟肾康汤低剂量组(P<0.05)，且芪蓟肾康汤高剂量组灌胃28 d后TGF-β1蛋白表达水平均明显低于芪蓟肾康汤中剂量组(P<0.05)。

3 讨 论

IgA肾病是临床上一种常见的原发性肾小球疾病，可发生于任何年龄段人群，但以青壮年患者为主，有30%～40%的患者病情可进行性恶化，导致终末期肾衰竭的发生，给患者的生命健康造成严重威胁，生活质量造成严重影响[8-9]。TGF-β1主要来源于上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及内皮细胞，是一种多功能的细胞因子，对细胞的生长、分化及免疫功能都有重要的调节作用，IgA肾病患者中TGF-β1的高表达可以促进肾小球系膜细胞大量增殖，促进成纤维细胞的生长，加速细胞的纤维化与硬化，对患者肾功能造成严重损伤[10]。Smads家族是将TGF-β1信号从细胞表面受体传导至细胞核的一组关键性蛋白，根据其在传导通路中作用的不同可分为受体激活型Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8,共同介导型Smad4,抑制型Smad6、Smad7[11]。活化的TGF-β1可激活Smad2、Smad3，使其与Smad4结合，进入细胞核内激活相应启动子的活性，激活细胞因子受体转导信号，促进细胞因子表达，介导肾纤维化的过程[12-14]。有研究也证实，TGF-β1/Smads信号转导通路过度兴奋被认为是导致细胞外基质沉积的主要原因之一，其高表达还能够上调纤维连接及层粘连蛋白合成量[15-16]。Smad7则是TGF-β1/Smads信号转导通路的负调节蛋白，可阻止Smad2、Smad3的磷酸化，阻止TGF-β1信号转导，抑制TGF-β1介导的肾小球硬化，减轻肾脏功能损害，研究表明Smad7水平升高可以明显延缓肾小球硬化的进展[17]。本研究结果也显示，模型组小鼠与空白组灌胃后同期比较，肾组织中Smad3 mRNA及TGF-β1、Smad2蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)，Smad7 mRNA表达明显降低(P<0.05)，表明模型组小鼠出现了肾纤维化的变化。

1 空白组；2 模型组；3 西药组；4 芪蓟肾康汤低剂量组；5 芪蓟肾康汤中剂量组；6 芪蓟肾康汤高剂量组

IgA肾病属中医学水肿、尿血、肾风、虚劳等范畴，病位在肾络，属本虚标实之证，以肾络亏虚为本，以邪壅肾络为标，其发病与肾络虚滞、肾络瘀阻有关。络脉是气血会聚之处，其生理功能不外聚、流、通、化，即可以贯通营卫，渗透气血，互化津血，是内外沟通的桥梁，故络脉气血畅通，则周身四肢、五脏六腑得以滋润而健康如常；络脉不通，气血不充，则五脏失和，七窍不通，留而为瘀毒导致络病[18]。肾作为络脉聚集之所，肾络既是联系肾脏内外之间的桥梁，同时也是留邪的场所，肾络气血畅达，则肾脏气化有序，能升能降，能开能阖，能出能入，能收能放，使气血津液得以施布于五脏六腑、四肢百骸，以保证机体的各种生理活动[19]。肾虚络损，瘀毒互结，气化失职，封藏失司，导致肾主藏精、主水、主气化等一系列功能失调，而引发肾脏诸病[20]。芪蓟肾康汤是我们临床常用的经验方，方中黄芪补气荣络，既能大补元气，健脾补肾，又能利水消肿；小蓟凉血止血，散瘀解毒消痈；重楼、白花蛇舌草清热解毒，消肿止痛，利湿通淋；牡丹皮、丹参活血化瘀，舒筋通络；老头草清热凉血，收敛止血止痢。诸药合用，共奏补气荣络、清热解毒、消瘀通络的功效。

本实验所用替米沙坦除有降低血压的作用外，还有减少蛋白尿和延缓肾功能恶化的肾脏保护作用，其通过对肾小球血流动力学的特殊调节作用，降低肾小球内高血压、高灌注及高滤过，起到缓解肾小球硬化进展的作用[21]。本研究结果显示，西药组及芪蓟肾康汤低、中、高剂量组灌胃28 d后与模型组同期比较对小鼠肾组织Smad3 mRNA、Smad7 mRNA及TGF-β1、Smad2蛋白表达均有明显改善(P<0.05)，且芪蓟肾康汤中、高剂量组灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA、Smad7 mRNA及TGF-β1蛋白表达改善均优于芪蓟肾康汤低剂量组同期(P<0.05)，芪蓟肾康汤高剂量组灌胃14、21、28 d后对Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表达水平改善优于芪蓟肾康汤中剂量组同期(P<0.05)，灌胃28 d后TGF-β1蛋白表达水平低于芪蓟肾康汤中剂量组同期(P<0.05)。提示芪蓟肾康汤对转基因IgA肾病小鼠治疗作用确切，其可能是通过多个靶点调节TGF-β1/Smads信号转导通路完成，预防肾纤维化，延缓肾小球硬化进展，增加剂量或延长疗程均可明显提高疗效。