菠萝PEPC基因家族生物信息学分析

马海洋 赵秋芳 陈曙 石伟琦 冼皑敏

摘  要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase， PEPC）在C₄和景天酸代謝（CAM）光合途径吸收CO₂过程中发挥重要作用，并参与各种非光合作用过程，包括果实成熟、气孔开放、碳氮相互作用、种子形成和萌发以及调节植物对逆境胁迫的耐受性。菠萝为典型的景天酸代谢途径（CAM）植物，为了解磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在菠萝景天酸代谢途径（CAM）中的作用，本研究鉴定到3个菠萝PEPC基因，按照基因描述命名为AcPEPC1、AcPEPC3和AcPEPC4，进化树分析结果AcPEPC1和AcPEPC3为植物型PEPC（PTPCs）蛋白，序列同源性较高且基因结构、保守结构域及保守基序均一致。AcPEPC4为细菌型PEPC（BTPCs）蛋白，与AcPEPC1/AcPEPC3间的序列同源性低。组织表达分析表明AcPEPC1菠萝叶片表达量较高，而AcPEPC3和AcPEPC4在菠萝花和果实表达量较高。

关键词：菠萝;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）;基因进化;基因表达谱中图分类号：S668.3    文献标识码：A

Bioinformatics Analysis of PEPC Gene Family in Pineapple

MA Haiyang^1，2， ZHAO Qiufang^1，2，3*， CHEN Shu^1，3， SHI Weiqi^1，2， XIAN Aimin^1，2

1. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. Hainan Key Laboratory of Tropical Crops Nutrition， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： Phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC） plays an important role in assimilating atmospheric CO₂during C₄and Crassulacean acid metabolism （CAM） photosynthesis， and participates in various nonphotosynthetic processes， including fruit ripening， stomatal opening， supporting carbon-nitrogen interactions， seed formation and germination， and regulation of plant tolerance to stresses. Pineapple is a typical CAM plant. In order to understand the function ofPEPC gene in pineapple CAM photosynthesis pathway， threePEPCgenes were identified in pineapple and nominated asAcPEPC1/AcPEPC3/AcPEPC4according to the gene description. Phylogenetic analysis showed that AcPEPC1 and AcPEPC3 protein belonged to the plant type PEPC （PTPCs） subfamily， which had high sequence homology. Gene structure， conserved domain and conserved motif of AcPEPC1 and AcPEPC3 had high similarity. AcPEPC4 belonged to the bacterial type of PEPC （BTPCs） subfamily which had low sequence homology with AcPEPC1/AcPEPC3. Different tissues expression assay showed that the expression ofAcPEPC1 was high in leaves， andAcPEPC3 and AcPEPC4 was highly expressed in flowers and fruits.

Keywords： pineapple （Ananas comosus （L.） Merr）; phosphoenolpyruvate carboxylase （PEPC）; gene evolution; gene expression profiling

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.014

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoe nol py ruvate carboxylase， PEPC）是一种细胞质酶，其主要功能是在Mg²⁺或Mn²⁺的辅助下，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和HCO₃^-生成草酰乙酸（OAA）和无机磷酸盐（Pi）的不可逆反应^[1]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶广泛分布于古菌、细菌、蓝藻、绿藻、原生动物和植物中，在动物和真菌中不存在^[2]。PEPC参与的催化反应是C₄代谢和景天酸代谢植物光合作用中CO₂同化和固定的主要步骤^[1]，同时PEPC还参与种子形成和萌发^[2-3]、果实成熟^[2]、气孔开放^[4]，调节植物对逆境胁迫的耐受性^[5-6]，为豆科植物根瘤共生氮固定提供碳骨架^[7]等非光合生理过程。目前，PEPC基因已在多种植物中被鉴定和研究，拟南芥和水稻中分别报道4个和6个PEPC家族成员^[8-9]，在大豆中共鉴定到10个（GmPEPC1～10）PEPC基因，其中GmPEPC6、GmPEPC8和GmPEPC9被铝毒、寒害、盐害等非生物胁迫诱导表达^[10]。花生基因组报道5个PEPC基因（AhPEPC1～5）^[11]，涂嘉琦等^[12]从蔓花生基因组中鉴定到9个PEPC基因。

菠萝是一种极具营养和药用价值的热带水果。2016年菠萝的全球生产总值高达到14.9亿美元（www.freshplaza.com），目前菠萝已成为世界第三大热带水果，第二大国际贸易的热带水果。2015年菠萝基因组测序和组装工作已经完成^[13]，为菠萝重要基因家族鉴定和分析提供了数据支持，菠萝WRKY^[14]、NRT^[15]、ABC^[16]、DOF^[17]等许多重要基因家族先后被报道。菠萝作为典型的CAM代谢植物，PEPC基因家族尚未被挖掘，其家族成员在菠萝光合过程中的作用尚不清楚，本文从菠萝基因组中鉴定出3个PEPC基因，并对其结构、序列特征及进化关系进行生物信息学分析，并结合转录组数据分析菠萝PEPC基因组织表达差异，为后期研究PEPC基因参与菠萝CAM光合代谢过程中物质积累和代谢调控作用机制奠定基礎。

1  材料与方法

1.1材料

菠萝（Ananas comosus L.）基因组和转录组数据来自（http：//pineapple.angiosperms.org），拟南芥数据来自（https：//www.arabidopsis.org/），水稻数据来自（http：//rice.plantbiology.msu.edu/），玉米数据来自（https：//www.maizegdb.org/）。

1.2方法

1.2.1  菠萝AcPEPC家族基因鉴定  菠萝AcPEPC家族基因鉴定参考涂嘉琦等^[12]的方法，从菠萝基因组数据库（http：//pineapple.angios pe rms.org）中检索菠萝的AcPEPC基因，同时获得其基因序列、转录本序列、CDS和氨基酸序列及染色体位置信息，并利用 Pfam 对AcPEPC候选基因进行进一步确认，凡包含PEPcase（PF00311）结构域蛋白为 PEPC蛋白家族成员。利用GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）工具绘制AcPEPC基因结构图，分析其外显子和内含子结构。

1.2.2  菠萝AcPEPC蛋白理化性质分析  运用 Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）在线工具分析AcPEPC蛋白成员的分子量、等电点、不稳定指数、总平均疏水性、脂溶系数;运用Plant-mPloc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant- multi/）预测AcPEPC蛋白的亚细胞定位，利用SOPMA（https： //npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）工具预测AcPEPC蛋白的二级结构。

1.2.3  菠萝AcPEPC蛋白保守结构域分析  利用 MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在线工具分析AcPEPC蛋白保守基序，基序长度范围为10～50个氨基酸残基，基序最大发现数目为10个，其他参数为默认值。利用SMART（http：// smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http：//pfam. xfam.org）在线工具分析AcPEPC蛋白的PEPcase保守结构域。

1.2.4  菠萝AcPEPC蛋白进化树分析  利用Clustalx（1.83）对拟南芥和菠萝AcPEPC蛋白序列进行同源序列比对，并利用 MEGA6软件构建拟南芥、水稻、玉米、菠萝AcPEPC蛋白家族的系统进化树，采用相邻连接法（Neighbor-Joining，NJ），校验参数 BootStrap 重复为 1000次，其他参数均为默认值。

1.2.5  菠萝AcPEPC基因的组织表达谱分析  在菠萝基因组网站（http：//pineapple.angiosperms. org/pineapple/html/index.html）获取菠萝AcPEPC基因的组织表达量（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped， FPKM）数据，包括菠萝根、白天和晚上叶片不同部位（S1-S6）、花、5个果实发育的阶段，以及叶片叶端（S5）和叶基部（S1）24 h表达量数据，采用TBtools工具绘制热图。

2  结果与分析

2.1菠萝AcPEPC家族基因成员鉴定

通过对菠萝基因组的检索和鉴定，共鉴定出3个PEPC基因（表1），按照基因描述命名为AcPEPC1（Aco010025.1），AcPEPC3（Aco018- 093.1），AcPEPC4（Aco016429.1）。其中AcPEPC1和AcPEPC4位于10号染色体，AcPEPC3位于11号染色体，基因方向均为正向。基因结构分析显示3个AcPEPC序列长度，编码序列长度存在差异，其序列长度在6246～9924 bp之间，编码序列长度在2895～3054 bp之间。AcPEPC1，AcPEPC3均包含9内含子和10个外显子，而AcPEPC4包含18个内含子和19个外显子（图1）。

2.2菠萝AcPEPC蛋白分析

AcPEPC1/3/4的氨基酸数目分别为964、966和1017 aa，分子量分别为109.87、110.29、114.71 kDa。等电点PI均小于7，均为带负电荷蛋白;不稳定指数均大于4，预测为不稳定蛋白;脂溶指数在90.05～92.09之间;对蛋白进行亲/疏水性预测，3个AcPEPC 的 GEAVY 值均为负值，均为亲水性蛋白（表2）。对菠萝AcPEPC二级结构进行预测分析，结果表明3个AcPEPC蛋白均以α-螺旋为主，占58.8%～62.14%，其次为无规则卷曲，占27.9%～31.76%，而扩展链结构和β-转角所占比例较小（表3）。亚细胞定位预测3个PEPC成员均定位于细胞质。

2.3菠萝AcPEPC蛋白保守结构域分析

3个菠萝PEPC蛋白均存在PEPcase保守结构域（图2），而AcPEPC1、AcPEPC3和AcPEPC4之间存在差异，AcPEPC1、AcPEPC3存在位置和大小均相似的1个PEPcase保守结构域，位置分别在162～966 aa和162～964 aa。AcPEPC4存在2个PEPcase保守结构域，分别位于140～329 aa和378～1017 aa。保守基序分析（图3）发现AcPEPC1、AcPEPC3存在10个保守基序，且位置和序列均较为相似;而AcPEPC4缺少基序10。

2.4菠萝AcPEPC蛋白序列比对和进化树分析

对拟南芥、水稻、玉米和菠萝共计19个PEPC蛋白进行进化树分析（图4）。3个AcPEPC被分为2类，其中AcPEPC1和AcPEPC3与ZmPEPC5的亲缘关系最近，为植物型PEPC（PTPC）蛋白，而AcPEPC4与ZmPEPC3，AtPPC4和水稻Osppc-b聚为一类，为细菌型PEPC（BTPC）蛋白。氨基酸序列一致性结果显示（表4），AcPEPC1和AcPEPC3的氨基酸序列相似性很高，达85.2%，且与拟南芥中PTPCs亚家族成员（AtPPC1、AtPPC2、AtPPC3）间的序列一致性均在82%以上，说明PTPCs亚家族的同源性很高，可能为同一基因进化而来的，而BTPCs亚家族成员AcPEPC4与PTPCs（AcPEPC1和AcPEPC3）的相似性分别为43.5%和43.0%，同源性較差，AcPEPC4与AtPPC4均为BTPCs亚家族成员，氨基酸一致性为74.8%。

2.5菠萝AcPEPC基因组织表达分析

为进一步分析AcPEPC基因在不同组织中的表达情况，本研究分析了不同组织在不同发育阶段的转录组数据，包括根、叶（叶片从叶基部至叶尖分为6个取样部位，依次为S1～S6，并分别在中午和晚上进行取样）、花和果实发育的5个阶段共19个样品数据，分析结果表明：AcPEPC1在叶片不同部位的表达量存在差异，分别在中午S4～S6，夜晚S5～S6表达量最高，在根中相对较低，其次为花，果实发育5个不同阶段AcPEPC1的表达量变化不大。AcPEPC3在根和果实发育前期（S1～S3）表达量相对较高，且在叶片S1～S3中的表达量高于叶片S4～S6。而AcPEPC4在花和果实发育各阶段表达量较高，在叶片和根中表达量低（图5）。这些表达量的差异说明其在菠萝光合作用中可能发挥不同功能。

如图例所示，热图中的不同颜色指示基因转录组水平，图中NO-S1至S6表示成熟叶片中午时从叶基部至叶尖的6个不同采样部位，NI-S1至S6表示成熟叶片晚上时从叶基部至叶尖6个不同采样部位，R表示根，Fl表示花，Fr-S1至S5表示果实发育的5个时期。

Different colors in heatmap refer gene transcript level as shown in the figure legend. NO-S1 to S6 represent 6 different parts from leaf base to leaf tip in the mature leaves at noon， NI-S1 to S6 represent 6 different parts from leaf base to leaf tip in the mature leaves at night， R represents root， Fl represents flower. Fr-S1 to S5 represent five stages of fruit development.

PEPC酶主要参与菠萝CAM光合过程，其在叶片光合部位和非光合部位，以及相同部位不同时间点的表达可能存在差异。分析结果表明：AcPEPC1主要在绿色叶端部位表达，表达量明显高于白色叶基部位，AcPEPC3在白色叶基部位的表达量高于绿色部位，而AcPEPC4在叶片绿色和白色部位的表达量均较低，在白色基部的表达量略高于绿色部位。3个AcPEPC基因在不同时间点的转录组表达差异不明显（图6）。

如图例所示，热图中的不同颜色指示基因转录组水平，图中Gr-6am至Gr-4am表示AcPEPC基因在叶端部位自早上6点到凌晨4点的表达情况，Wh-6am至Wh-4am表示AcPEPC基因在叶基部位自早上6点到凌晨4点的表达情况。

Different colors in heatmap refer gene transcript level as shown in the figure legend. Gr-6am to Gr-4am representAcPEPCgene 24 h expression profiles at leaf tip （Gr） from 6 am to 4 am， Wh-6am to Wh-4am representAcPEPCgene 24 h expression profiles at leaf base （Wh） from 6 am to 4 am.

3  讨论

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在C₄和CAM植物的光合作用过程中CO₂的吸收发挥重要作用，并参与多种非光合作用过程。菠萝作为典型的CAM植物，其PEPC基因的研究尚未见报道。本研究从菠萝基因组中鉴定到3个PEPC家族成员。前期研究表明植物中存在2种类型的PEPC家族基因，包括植物型PEPC（PTPC）和细菌型PEPC（BTPC），拟南芥编码的4个PEPC基因中3个属于PTPCs，1个属于BTPCs^[8]，在水稻中5个PEPC（Osppc1，2a，2b，3and4）为PTPCs，Osppc-b为BTPCs^[9]。大豆中7个PEPC基因（GmPEPC3，4，6，7，8，9，1）属于PTPCs，3个PEPC基因（GmPEPC1，2，5）属于BTPCs^[10]。花生中4个PEPC基因（AhPEPC1～4）属于PTPCs，1个基因（AhPEPC5）属于BTPCs^[11]。本研究中AcPEPC1和AcPEPC3属于亚家族PTPCs，且与ZmPEPC5的进化关系最為相近，AcPEPC4与AtPEPC4，Osppc-b和ZmPEPC3聚在一起，属于亚家族BTPCs。研究表明PTPCs亚家族通常编码约为110 kDa大小的蛋白，且在N端具有保守的磷酸化作用位点，基因结构由10个左右的外显子组成，而BTPCs亚家族编码分子量约为117 kDa的氨基酸，且缺乏N端的磷酸化位点，基因结构由20个左右的外显子组成^{[2， 8]}。对菠萝的研究有相似的结果，菠萝PTPCs（AcPEPC1，AcPEPC3）亚家族编码约为110 kDa的蛋白，包含10个高度同源的外显子，BTPCs（AcPEPC4）编码114.71 kDa的蛋白，包含19个外显子（图1，表2）。所有的PTPCs都是由共同的祖先基因进化而来的，具有高度的保守性^[18]，而BTPCs与PTPCs的序列同源性较低（<40%）^[19-20]，本研究中AcPEPC1和AcPEPC3的同源性高达85.2%，且与拟南芥中PTPCs成员的同源性均在82%以上，与BTPCs成员的同源性均在40%左右。保守基序分析发现AcPEPC1和AcPEPC3具有10个保守基序，且位置序列相对一致，而AcPEPC4缺少保守基序10。

前期报道PEPC基因广泛存在于植物的组织中，且表达具有组织特异性。例如Atppc4在花、根和果实表达^[8]，蔓花生AdPEPC家族多数成员在花和茎中表达量较高^[12]，花生中AhPEPC1在根、叶和种子表达量高，而在茎中表达量低，AhPEPC2在叶片表达量高，其他组织表达量低，AhPEPC3在根中表达量高，其次为种子，AhPEPC4 叶片中表达量高，其次为种子，而AhPE PC5在根和叶片中的表达量高于其他组织^[21]，GmPEPC5在茎和叶中的表达水平较高，而在花和根中的表达水平低^[10]。本研究中，AcPEPC不同成員在不同组织部位中的表达量不同，其中AcPEPC1在叶片中的表达量较高，在根和花中的表达较低，且AcPEPC1在叶片叶端（S4～S6）的表达量显著高于叶片叶基（S1～S3），AcPEPC3与AcPEPC1相反，AcPEPC3在根和果实中的表达量较高，在叶片中的表达较低，在S1～S3的表达量高于S4～S6。而AcPEPC4在花和果实发育的表达量高于叶片和根（图5）。进一步分析发现AcPEPC1在叶端（S1）24 h的表达量均高于叶基部（S5），AcPEPC3同样呈现相反的趋势（图6）。AcPEPC4在叶端（S1）和叶基部（S5）24 h的表达量均较低这与AcPEPC4在叶片中的表达量较低结果相一致（图5）。菠萝不同PEPC成员表达差异其在光合过程中发挥的作用不同，AcPEPC1在叶端表达量较高，说明AcPEPC1可能是参与景天酸代谢过程中CO₂吸收的关键基因，而AcPEPC3和AcPEPC4可能主要参与菠萝花和果实的发育，本研究结果为进一步研究PEPC基因在菠萝中的功能提供依据。

参考文献

[1] Izui K， Matsumura H， Furumoto T， et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase： a new era of structural biology[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55： 69-84.

[2] OLeary B， Park J， Plaxton W C. The remarkable diversity of plant PEPC （phosphoenolpyruvate carboxylase）： recent insights into the physiological functions and post-translational controls of non-photosynthetic PEPCs[J]. Biochemical Journal， 2011， 436（1）： 15-34.

[3]OLeary B， Fedosejevs E T， Hill A T， et al. Tissue-specific expression and post-translational modifications of plant- and bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase isozymes of the castor oil plant，Ricinus communis L.[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（15）： 5485-5495.

[4]Cousins A B， Baroli I， Badger M R， et al.The role of phosphoenolpyruvate carboxylase during C₄photosynthetic isotope exchange and stomatal conductance[J]. Plant Physiology， 2007， 145（3）： 1006-1017.

[5]Doubnerová H?sková V， Miedzińska L， Dobrá J，et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase， NADP-malic enzyme， and pyruvate， phosphate dikinase are involved in the acclimation ofNicotiana tabacumL. to drought stress[J]. Journal of Plant Physiology， 2014， 171（5）： 19-25.

[6]Cheng G， Wang L， Lan H. Cloning ofPEPC-1from a C₄halophyteSuaeda aralocaspicawithout Kranz anatomy and its recombinant enzymatic activity in responses to abiotic stresses[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2016， 83（11）： 57-67.

[7] Raghavendra A S， Sage R F. C4 Photosynthesis and Related CO₂Concentrating Mechanisms[J]. Advances in Photosynthesis and Respiration， 2011， 32： 257-275.

[8] Sánchez R， Cejudo F J. Identification and expression analysis of a gene encoding a bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase fromArabidopsisand rice[J]. Plant Physiology， 2003， 132（2）： 949-957.

[9]Muramatsu M， Suzuki R， Yamazaki T，et al.Comparison of plant-type phosphoenolpyruvate carboxylases from rice： identification of two plant-specific regulatory regions of the allosteric enzyme[J]. Plant and Cell Physiology， 2015， 56（3）： 468-480.

[10] Wang N， Zhong X， Cong Y，et al. Genome-wide analysis of phosphoenolpyruvate carboxylase gene family and their response to abiotic stresses in soybean[J]. Scientific Reports， 2016， 6（1）： 38448-38462.

[11]Shan-Lin Y U， Pan L J， Yang Q L，et al.Identification and expression analysis of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene family in peanut （Arachis hypogaea L.）[J]. Agricultural Sciences in China， 2001， 9（4）： 477-487.

[12] 涂嘉琦， 甘  璐， 馮兰兰，等. 蔓花生PEPC基因家族的生物信息学分析[J]. 热带亚热带植物学报， 2018， 26（2）： 107-115.

[13] Ming R， VanBuren R， Wai C M，et al.The pineapple genome and the evolution of CAM photosynthesis[J]. Nature genetics， 2015， 47（12）： 1435-1442.

[14] Xie T， Chen C， Li C，et al.Genome-wide investigation of WRKY gene family in pineapple： evolution and expression profiles during development and stress[J]. BMC genomics， 2018， 19（1）： 490-518.

[15] Li W， Yan M， Hu B， et al.Characterization and the expression analysis of nitrate transporter （NRT） gene family in pineapple[J]. Tropical Plant Biology， 2018， 11（3-4）： 177-191.

[16] Chen P， Li Y， Zhao L，et al.Genome-wide identification and expression profiling of ATP-binding cassette （ABC） transporter gene family in pineapple （Ananas comosus （L.） Merr.） reveal the role of AcABCG38 in pollen development[J]. Frontiers in plant science， 2017， 8： 2150.

[17] Azam S M， Liu Y， Rahman Z U，et al.Identification， characterization and expression profiles of dof transcription factors in pineapple （Ananas comosusL.） [J]. Tropical plant biology， 2018， 11： 49-64.

[18] Svensson P， Blasing O E and Westhoff P. Evolution of C₄ phosphoenolpyruvate carboxylase[J]. Archive Biochemistry Biophysics， 2003， 414： 180-188.

[19] Sullivan S， Nimmo J H G. Roots， cycles and leaves， expression of the phosphoenolpyruvate carboxylase kinase gene family in soybean[J]. Plant Physiology， 2004， 135（4）： 2078-2087.

[20] Igawa T， Fujiwara M， Tanaka I，et al. Characterization of bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase expressed in male gametophyte of higher plants[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）： 200-212.

[21] Pan L， Zhang J， Chen N，et al.Molecular characterization and expression profiling of the phosphoenolpyruvate carboxylase genes in peanut （Arachis hypogaea L.） [J]. Journal of Plant Physiology， 2017， 64（4）： 576-587.