长链非编码RNA HOXA11-AS在结直肠癌患者血清中的表达和意义*

李安明，王旭东，鞠少卿，高灵宝△

(1.南通大学第五附属医院输血科，江苏泰州 225300；2.南通大学附属医院检验科，江苏南通 226000)

结直肠癌是临床最常见的消化道恶性肿瘤之一，在全球发病率居恶性肿瘤的第4位，病死率居第2位[1]。尽管最近在治疗和实验肿瘤学方面取得了进展，但诊断为结直肠癌的患者预后仍然很差[2]。因此，早期诊断结直肠癌对改善患者的生活质量和提高生存率有着极其重要的意义[3]。HOXA11-AS 是近年来发现的长链非编码RNA(lncRNA)分子，在胃癌和上皮性卵巢癌中均有重要作用[4-5]。在对肿瘤的鉴别诊断方面，目前研究者们大多采用的方法是从组织中提取lncRNA，再将肿瘤组织的某种或某几种lncRNA的表达水平和癌旁组织进行比对[6-8]。从组织中提取的lncRNA比从血清中提取的lncRNA丰度高，有利于对提取的lncRNA进行后续一系列的研究，但其取材困难，对患者造成的创伤较大，难以推广，因而对血清lncRNA的研究尤为重要。本文就lncRNA HOXA11-AS在结直肠癌患者血清中的表达及其临床价值进行探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年4月至2016年9月南通大学附属医院结直肠癌初诊患者血清标本53例(男性33例、女性20例，年龄37～81岁，中位数61岁)，结直肠息肉患者42例(男性25例、女性17例，年龄43～80岁，中位数64岁)，结直肠癌术后复发或转移患者20例(男性12例、女性8例，年龄48～82岁，中位数66岁)，门诊体检健康者40例(男性24例、女性16例，年龄43～80岁,中位数63岁)。对16例结直肠癌手术患者采集各时间段的血清标本并进行术前、术后追踪随访。纳入标准：经过内镜室活检及手术后经病理证实为结直肠癌的初诊患者。排除标准：(1)结直肠癌初诊患者在手术前均未接受过化疗、放疗及免疫治疗且未合并其他肿瘤；(2)结直肠息肉患者均未合并其他疾病；(3)体检健康者的白细胞计数为在(4～8)×109/L且肝肾功能均在正常范围。本研究获得该院伦理委员会批准，所有标本均得到受试者的知情同意后进行采集。

1.2仪器与试剂 主要仪器：落地式多用途离心机购自日本Hitachi公司，型号CF16RX；逆转录扩增仪购自美国Bio-Rad公司；实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，型号7500；制冰机购自日本Sanyo公司，型号SIM-F140AY65；-80 ℃超低温冰箱购自美国Backman-Coulter公司；化学发光仪购自美国雅培诊断有限公司；漩涡振荡仪购自德国Ika公司，型号MS 3digital；微量离心机购自日本Tomy公司，型号PMC-880；紫外分光光度计购自德国Implen公司，型号Nano Photometer。主要试剂：异丙醇、无水乙醇购自中国国药集团化学试剂有限公司；HOXA11-AS、GAPDH荧光定量PCR引物购自中国广州锐博生物科技有限公司；血液(液体标本)总RNA快速提取试剂盒购自中国北京百泰克生物技术有限公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo公司；荧光染料SYBR Green Ⅰ Master购自德国Roche公司。

1.3方法

1.3.1标本采集 采用含分离胶的真空管采集血液标本，3 000 r/min离心15 min，将2 mL血清立即移入无菌小型离心管内，并于-80 ℃冻存备用。

1.3.2实时荧光定量PCR 取3 μL cDNA，采用相对定量的方法进行实时荧光定量PCR；每次PCR反应时另取由60例体检健康者混合血清组成的对照血清作为每次反应的参比；采用相对定量PCR的方法计算相对表达值；HOXA11-AS的上游引物序列为5′-GTA AGG CTG TGA CAT TGG-3′，HOXA11-AS下游引物序列为5′-GCT CTG GGT TGA CGA TAA-3′；GAPDH上游引物序列为5′-CCC TTC ATT GAC CTC AAC TA-3′，GAPDH下游引物序列为5′-TGG AAG ATG GTG ATG GGA TT-3′。反应条件为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 31 s，72 ℃ 31 s，45个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。58～95 ℃收集荧光，通过熔解曲线评估PCR反应的特异性。血清HOXA11-AS的检测及参考值：收集53例结直肠癌初诊患者，16例结直肠癌手术患者，20例结直肠癌术后复发或转移患者，42例结直肠息肉患者和40例同期门诊体检健康者的血清标本。在优化PCR反应条件后，采用实时荧光定量PCR的方法检测HOXA11-AS的相对表达值。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，根据约登指数定义，选取ROC曲线下特异度与灵敏度之和最大时所对应的RQ值为临界值，血清HOXA11-AS水平≥临界值时为阳性结果，反之则为阴性结果。

1.4统计学处理 使用Graphpad Prism 5.0版软件进行绘图，SPSS19.0版软件进行统计学分析。各组血清HOXA11-AS相对表达量以RQ值中位数(四分位数)[M(P25～P75)]表示；两个独立标本比较，采用独立标本t检验，多个独立标本比较采用单因素卡方检验；ROC曲线及曲线下面积(AUC)评价血清HOXA11-AS检测对结直肠癌的诊断效能，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1线性分析 将混合对照血清cDNA进行10倍梯度稀释后绘制标准曲线。计算GAPDH的标准曲线为Y=-3.319 8X+24.972，χ2=0.987 9；HOXA11-AS的标准曲线为Y=-3.040 4X+28.511，χ2=0.992 1；依据扩增效率公式E%=(10-1/斜率-1)×100%计算得该法扩增效率为EGAPDH%=100.09%，EHOXA11-AS%=113.26%，说明该检测方法线性良好，即可以检测血清中不同水平的HOXA11-AS。

2.2重复性与特异性 将同一份混合血清参照品的同一批次进行20个平行孔检测HOXA11-AS和GAPDH，统计循环阈值(Ct值)计算批内变异系数(CV)；将混合血清等分成20份，每天1份，连续检测20天，统计Ct值测得批间重复性；计算批间CV。实时荧光定量PCR熔解曲线呈平滑单峰，HOXA11-AS熔解温度为76.00 ℃。见表1。

表1 HOXA11-AS和GAPDH批内/批间重复性

2.3比较均值 对53例结直肠癌初诊患者、42例结直肠息肉患者和40例体检健康者血清HOXA11-AS的相对表达值进行检测，结直肠癌初诊患者的相对表达值显著高于结直肠息肉患者(t=6.622,P<0.05)和体检健康者(t=6.535，P<0.05)，结直肠息肉患者M(P25～P75)为1.25(0.86～1.45，体检健康者M(P25～P75)为1.17(0.67～1.40)，差异比较无统计学意义(t=0.519，P=0.605)。见图1。

图1 结直肠癌初诊患者、结直肠息肉患者、体检健康者血清HOXA11-AS相对表达量

2.4诊断效能 对53例结直肠癌初诊患者和40例体检健康者血清HOXA11-AS水平进行检测。AUC为0.867 2(95%CI0.792 8～0.941 6)。将血清HOXA11-AS相对表达值1.495设为临界值时，HOXA11-AS作为结直肠癌血清诊断标志物的特异度为83.02%，灵敏度为80.00%，阳性预测值为82.49%，阴性预测值为85.59%。见图2。

图2 结直肠癌初诊患者与体检健康者的ROC曲线

2.5追踪随访 对53例结直肠癌初诊患者、16例结直肠癌手术患者、20例结直肠癌术后复发或转移患者血清HOXA11-AS进行检测比较。3组间两两比较结直肠癌术后复发或转移患者血清HOXA11-AS显著高于结直肠癌初诊患者(t=7.141，P<0.05)和结直肠癌手术患者(t=4.673，P<0.05)；追踪16例患者血清HOXA11-AS表达各异，但总体术后较术前呈下降的趋势(t=3.666，P=0.000)。见图3。

图3 结直肠癌初诊、结直肠癌手术和结直肠癌术后复发或转移患者血清HOXA11-AS相对表达量

2.6生存曲线分析 在长期随访观察中，笔者发现HOXA11-AS高表达组患者(n=27)的生存时间明显低于HOXA11-AS低表达组(n=26)，HOXA11-AS高表达组患者的总体生存率明显低于HOXA11-AS低表达组患者(t=2.463,P<0.05)。见图4。

图4 结直肠癌生存曲线分析

3 讨 论

近几年关于血清lncRNA的研究在国内逐渐受到重视，lncRNA与肿瘤之间的关系也逐渐得到证实[9-14]。人类全基因组分析显示，基因组中只有不超过2%的序列能够编码出有生物学功能的蛋白质，而超过90%的序列会被转录成非编码RNA[15-18]。其中的lncRNA是分子生物学领域近来的研究热点。大量的文献显示，lncRNA广泛参与了各种生理和病理过程，包括染色体修饰、细胞分化、免疫反应和疾病状态。杨歆[19]成功建立了血清中lncRNAs(linc01608、linc00594、rp11-91j3.3、h19及HOTAIR)的检测方法。SVOBODA等[20]研究发现，大肠癌原发灶和血液中HOTAIR相对表达上调与预后不良有关，其水平可能是评估散发性结直肠癌预后的替代标记。这些研究为血清lncRNAs的临床应用奠定了基础。

本研究成功建立起了一种稳定、灵敏、特异的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测血清HOXA11-AS的方法，方法的可行性为后期的实验研究数据的可靠性打下了坚实的基础。另外结果还显示，HOXA11-AS有成为结直肠癌血清诊断标志物的潜在价值，且在联合检测的应用上意义显著，能够明显提高结直肠癌初诊患者的诊断效能。在预后方面，对同一患者进行的术前、术后不同时间段的追踪实验结果显示，16例患者血清循环HOXA11-AS在结直肠癌术后总体较术前呈下降趋势，故HOXA11-AS的检测可用于术后病情监测。生存曲线分析HOXA11-AS发现，53例患者中HOXA11-AS高表达组的患者总体生存时间比HOXA11-AS低表达组的患者要短。从而证实血清中HOXA11-AS可作为结直肠癌诊断及预后判断的良好指标。

4 结 论

血清HOXA11-AS能通过实时荧光定量PCR法稳定可靠地检测，可作为新型分子诊断标志物，辅助诊断结直肠癌，评价治疗效果和评估预后。