二氢杨梅素的检测、药效及药代学研究进展

罗 俊，刘 丹，丁利君

（广东工业大学 轻工化工学院，广东 广州 510006）

随着现代人对生活水平的需求不断提高，人们开始对自身健康以及食品营养安全等问题越来越重视。二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DMY)是葡萄科蛇葡萄属的一种木质藤本植物中的黄酮类化合物，又名双氢杨梅素、蛇葡萄素、白蔹素等，是一种双氢黄酮醇化合物。该类植物广泛分布于我国如广东、广西、云南、湖南、湖北、江西等多个省。DMY在植物中其分布状态以老叶较高，嫩枝叶次之，茎枝与根中微量[1]。DMY作为一类比较特殊的天然黄酮类产物，在植物中单体含量高，常被广泛用作新型毒副作用低的产品。目前，已有大量研究者对DMY进行研究，本文拟对从DMY的含量测定、结构鉴定、药效和药代等方面进行综述，以期为DMY的深入研究及进一步开发利用提供理论依据。

1 DMY的含量测定和结构鉴定

DMY是一种多酚羟基双氢黄酮醇，是黄酮类化合物的一种，具有多种生物活性。天然黄酮类化合物的表征和定量分析对许多研究者来说都是一个挑战。目前对黄酮化合物(DMY)含量和结构的检测主要分为光谱法和色谱法。

1.1 光谱法

黄酮类化合物的紫外光谱图主要有环肉桂酰系统引起的吸收带I(300～550 nm)和环苯酰系统引起的吸收带Ⅱ(240～280 nm)[2]。紫外分光光度法(Ultraviolet and Visible spectrophotometry，UV)主要包括ZrOCl2·8H2O显色法、AlCl3显色法和直接检测法[3]。目前紫外分光光度法对总黄酮的检测原理主要是亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法，通过有色络合物的特征吸收峰实现检测目的。覃洁萍等[4]通过测定藤茶样品溶液与ZrOCl2络合前后的吸光度差值确定DMY的含量。安丰田等[5]通过紫外可见分光光度法测酶解法提取的藤茶中DMY含量。成桂凤等[6]比较了DMY的直接UV法和AlCl3显色法，以经纯化的DMY为标准品，在波长为291 nm处测定藤茶中总黄酮的含量。林淑英等[7]采用紫外-可见光谱扫描法研究pH值、温度以及金属离子对于DMY化学结构稳定性的影响。另外，通过加入诊断试剂，测定紫外-可见光谱图，可解析出黄酮类化合物的结构[8]。

黄酮类化合物的鉴定是依赖多种光谱学方法进行解析。傅立叶变换红外光谱法(Fourier Transform infrared spectroscopy，FT-IR)可以用于从自然资源中分离的复杂黄酮类化合物的结构鉴定[9]。Wang等[10]提出FT-IR可以快速地区分外消旋体(±)DMY与同质(+)DMY，借助与茶碱共结晶的作用，确定了同质(+)DMY的绝对构型为(2R，3R)。核磁共振波谱(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)和质谱(Mass Spectrometry，MS)也可用于研究黄酮类化合物的化学结构。核磁共振氢谱和碳谱可以为黄酮类化合物的结构鉴定提供丰富的化学信息，MS分析基于电离化学物质和离子的质量荷电比，可以用来研究多酚类黄酮化合物的结构[11]。Outtrup[12]使用1H-NMR、13C-NMR和MS对DMY的纯度和空间结构完整性进行了研究。占春熙等[13]也用MS、NMR等方法对藤茶中的提取物进行结构分析，分析证明提取物是二氢杨梅素。

1.2 色谱法

利用薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)、高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)和高效逆流色谱(High Performance Countercurrent Chromatography，HPCCC)等色谱技术，可以对DMY等植物提取物中黄酮类化合物进行含量测定和结构鉴定。TLC具有快速、操作简便、稳定、准确等特点，可以对黄酮类化合物进行结构鉴定、含量测定。谢雪佳等[14]利用薄层色谱法研究冷却结晶工艺中关键参数对DMY纯度的影响。何桂霞等[15]采用薄层扫描法测定藤茶中DMY的含量，结果显示藤茶中DMY的含量为38.17%～38.54%。

HPLC法有简便、快速、检测准确度高等特点，是一种较理想的黄酮类化合物的鉴别和定量方法。陈图锋等[16]采用高效液相色谱法在波长290 nm处测定藤茶中DMY含量，结果显示DMY的质量浓度含量在0.15～94.00 mg/L范围内有良好的线性关系。邹海民等[17]采用C18柱反相高效液相色谱检测法对醒酒护肝产品中DMY进行含量检测，可用于醒酒护肝产品的质量控制。

黄酮类化合物色谱分析还包括HSCCC法和HPCCC法。HSCCC法是一种全液相色谱技术，非常适合分离纯化合物。Du Qizhen等[18]采用制备的三柱逆流色谱对葡萄叶提取物中的(+)-DMY进行了纯化，在254 nm处的(+)-DMY进行含量测定，纯度可达99%以上。张友胜等[19]采用高速逆流色谱联用系统对藤茶提取物中的DMY进行纯化，纯度能达到99%以上。高效逆流色谱法(HPCCC)是建立在无支撑液-液离心分离层析的基础上，可用于植物提取物中黄酮类化合物的快速分离和回收。Vieira等[20]采用HPCCC方法成功地从凤仙花粗提物中分离出包括DMY在内的主要黄酮类化合物。

近年来，色谱技术与光谱技术联用在天然产物中复杂类黄酮化合物的结构鉴定中发挥着越来越重要的作用。Gao等[21]采用传统溶剂萃取和再结晶法从罗汉果叶中提取的两种黄酮类化合物通过紫外光谱法、红外光谱法、电喷雾质谱法(Electrospray Ionization Mass Spectrometry，ESI-MS)、核磁共振光谱法和高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC/ESI-MS)，确认两种产品中主要黄酮类化合物为(+)DMY。Li等[22]利用超高效液相色谱-串联四级杆质谱(UPLC-MS/MS)成功地分析了软枣猕猴桃品种代谢产物有DMY。Zhang等[23]采用超高效液相色谱-四极质谱联用技术(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-quadrupole Mass Spectrometry，UHPLC-MS)成功地同时测定了山梨花中DMY质量分数含量为6.76～7.89 mg/g。

2 DMY的药效作用

2.1 抗氧化作用

DMY为活性黄酮类物质，具有良好的抗氧化活性。郭清泉等[24]采用量子化学计算法研究了DMY的抗氧化机制，认为DMY的抗氧化活性中心在其分子结构的B环3'、4'、5'位连酚羟基上，抗氧化活性主要与其供氢后生成自由基的稳定性有关。郑秋闿等[25]利用核磁共振氢谱研究DMY的抗氧化机制，也得出了DMY的抗氧化活性中心在其分子中B环的3个相邻的羟基上。

通过DMY对羟自由基·OH、超氧阴离子自由基O2-·和脂过氧自由基ROO·清除效果进行对比分析和研究发现，在一定质量浓度的范围内，DMY浓度越高，那么整体清除能力也会随之提升[26]。En-Hua W等[27]以过氧化值(Peroxide Value，POV)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)为氧化指标研究发现DMY能够明显抑制贵州传统香肠的氧化，其抗氧化效果随着DMY添加量的增加继而增强。Li Y Y等[28]以大豆油和熟牛肉为模型体系，发现大豆油提取物及其主要成分DMY有抗氧化活性，采用硫代巴比妥酸反应性物质法可以测定熟牛肉的氧化程度。

DMY的抗氧化作用不仅应用在食品中，还可以通过抑制自由基对体内组织器官的损坏而发挥抗氧化作用。王丹等[29]灌胃大鼠不同剂量的DMY，测定其对大鼠细胞内MDA含量的影响，结果显示DMY在体内起到了清除自由基、抗氧化的作用，并且抗氧化活性优良。DMY还可以通过加速自由基的清除，增强小鼠的抗氧化能力[30]。

2.2 抗菌抗病毒作用

DMY抗菌主要是通过破坏细菌的细胞壁及细胞膜的完整性，从而让蛋白质、多糖等细胞内容物释放，引起膜功能障碍，影响细胞的新陈代谢，导致菌体死亡从而起到抗菌作用[31]。

Wu Y等[32]研究发现DMY对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性，最低抑菌质量浓度为0.125 mg/mL，DMY不仅破坏了金黄色葡萄球菌的膜完整性，通过与膜脂、膜蛋白相互作用，导致膜流动性显著降低，从而膜蛋白构象发生改变。此外，DMY还通过沟槽结合模式与金黄色葡萄球菌中DNA相互结合。DMY通过细胞膜损伤和与DNA结合的双重作用达到杀菌作用。谭潇啸[33]在扫描电镜下观察DMY作用金黄色葡萄球菌后，与正常形态的菌体相比，其形态会随着作用时间的增加继而发生严重皱缩、干瘪、扭曲变形等现象，说明了DMY对金黄色葡萄球菌有抗菌作用。

Liu D等[34]通过对细胞形态、细胞损伤、细胞通透性、细胞表面疏水性和抗菌率的分析，发现DMY对副溶血性弧菌具有抗菌活性，最小抑菌质量浓度为0.625 mg/mL。在较高浓度条件下，细菌细胞完全灭活。此外，Ding L等[35]等利用分子对接研究了DMY与脯氨酸脱氢酶(Proline Dehydrogenases，PDH)活性疏水囊内的初级氨基酸残基相互作用，导致PDH活性下降。DMY通过干扰了脯氨酸的正常代谢，导致副溶血性弧菌细胞的分子损伤甚至死亡。

DMY不仅对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出较强的抗菌活性，还对病毒具有一定的抑制作用。Liu D Y等[36]通过体外抗病毒实验发现DMY在HIV-1(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的吸收、培养和急性感染过程中具有较强的抑制作用，对HIV-1感染敏感细胞有保护作用，能显著降低HIV-1抗原的表达，在1 mg/mL的质量浓度下，DMY对HIV-1共受体CXCR 4的降解率约为70%。刘淼淼[37]研究发现DMY在体外能明显地抑制甲型流感病毒的早期复制，主要是通过作用于流感病毒的PB2cap影响病毒vRNP的活性。DMY也能通过TLR3信号通路调控流感病毒感染导致的过度炎症免疫反应。

2.3 抗肿瘤及其他药效作用

DMY具有良好的抗肿瘤作用，目前研究发现该化合物通过抑制卵巢癌细胞[38]、骨肉瘤细胞[39]、肝癌细胞[40]、黑色素瘤细胞[41]等癌细胞的生长增值、调节增强细胞免疫功能作用达到促进肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭迁移的效果。DMY可通过介导活性氧自由基的生成选择性地来调节细胞死亡。具体抗肿瘤效果和机制在此不做详细阐述，可参阅文献[42-43]。

此外，DMY还具有改善动脉粥样硬化、降血糖、改善肝脂肪变性、解酒护肝等作用。Liu T T等[44]等利用低密度脂蛋白受体缺陷小鼠研究发现DMY能改善高脂饮食诱导的动脉粥样硬化。逯凤肖[45]发现高剂量DMY能使糖尿病小鼠血糖极显著降低，胰岛素升高，增强糖尿病小鼠的糖耐量，改善糖尿病小鼠的高血糖症状。Xie C等[46]以正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2为模型，DMY能通过抑制脂质积累和氧化应激来改善oa诱导的肝脂肪变性。相关实验证明DMY可以保护肝脏，加速乙醇代谢产物乙醛迅速分解，变成无毒物质，降低对肝细胞的损害。潘人琦等[47]将小鼠给酒前和给酒后分别灌胃DMY，观察到醉酒小鼠给予DMY后，药效发挥迅速，能显著缩短醒酒时间，并且作用持久，是保肝护肝，解酒醒酒的良品。最近，在美国已经有出售含有DMY成分的解酒产品。

3 DMY的药代动力学

DMY虽然具有很多药效作用，但药效的发挥需要了解药物在生物体内吸收、分布、代谢、排泄等过程动态变化规律，一般经过口服给药后经过消化道、肠道菌群作用后，部分被吸收进入血液，通过血液运输到器官，发挥功效。中药血清药理学，可模拟药物的体内代谢过程实现体外实验的有效性[48]。了解DMY的药代动力学机制能为药效的发挥提供依据，是评价其生物利用度有效性和药物摄入水平的关键。然而，关于DMY在动物模型和人体中吸收、分布、代谢以及排泄等的相关研究目前还较少。

人体吸收黄酮类化合物主要是发生在胃以及肠道里。Liu等[48]的药代动力学研究发现DMY在肠道环境中不稳定，这表明DMY可能在肠道中被吸收。Xiang等[49]使用人肠道Caco-2细胞模型对DMY体外肠道稳定性进行了研究，当pH值由8.0降至6.0时，对DMY吸收明显增强，表明胃肠道pH是影响DMY稳定性、吸收和生物利用度的一个重要因素。在人体肠道中存在的外排转运蛋白被认为是影响药物吸收的另一个因素。黄酮类化合物因其特有的结构经胃肠道代谢后很容易成为外排转运蛋白的底物，从而影响其吸收,但也可以利用这一特点，增加药物的吸收，提高生物利用度。Xiang等[49]发现了多药耐药蛋白2 (Multi-drug Resistance associated Protein 2，MRP2)和乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance Protein，BCRP)参与了DMY的摄取和转运，阻碍了DMY在肠道中的吸收。

药物的分布在一定程度上说明药物对机体的靶向性，研究药物的体内分布情况可为阐明药物的作用机制及其有效性做出合理解释[50]。王志琪[51]研究发现大鼠口服一定量的DMY后0.33 h即可在肝和肾中检测到DMY，在设定的时间内组织药物浓度随时间没有明显的变，肾组织药物浓度高于肝组织药物浓度，脑组织在设定的时间点未检测到DMY。樊静静等[52]给药大鼠有效剂量DMY后，各组织的药物浓度变化趋势与血浆代谢较吻合，20 min时各组织的浓度具有心＞肝＞肺＞胃＞肾＞脾的特点，浓度较高的心肝肺胃肾可能是DMY发挥药效的靶向器官；140 min时各组织中药物浓度消除接近最高浓度的90%，表明DMY在体内消除快，不易蓄积，能较快发挥药效。

最近，Fan等[53]研究了对大鼠口服DMY后组织分布、代谢和排泄情况，提出了5种代谢途径，包括还原、去羟基化、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸盐化。实验结果表明，未转化的DMY可迅速分布于各种组织，尤其是胃肠道，并能跨越血脑屏障，到达中枢神经系统。DMY的排泄也很迅速，几乎可以在12 h内完成。大部分未转化的DMY是在粪便中发现的，而不是在尿液中。在尿液和粪便中检测DMY代谢物，但是血浆中几乎没有发现任何代谢物，这可能是由于经过了不同的排泄途径。黄酮类化合物的代谢产物通常有两种排泄途径[54]：通过胆汁或尿。大的代谢物更容易在胆汁中被转化，而小的代谢物更容易在尿液中排泄。在通过胆汁排出时，黄酮类化合物还可以被肠道细菌进一步代谢并被大肠吸收，继而进行下一轮肝脏代谢。

4 研究与展望

DMY是一种药用价值极高的植物黄酮类化合物，作为一种新型毒副作用低的产品，其应用范围极其广泛，主要是体现在抗氧化、抗菌、抗肿瘤、解酒护肝、降血糖等药效方面，但是有关药代动力学研究还不够系统和深入。目前，关于DMY含量测定、结构鉴定和药效作用已有比较广泛的研究，通过药效作用的分析，可以预测其作用靶点，为DMY在临床的应用提供了一定的理论基础。但是由于DMY自身溶解性差、生物利用度低以及药代动力学等问题，使其应用将受到影响。因此，DMY的生物利用度的改善和将药代动力学研究运用到不同动物试验中推测其在生物体内的药代动力学，是今后研究的热点方向。要以现有资料为基础，更加全面系统地开发DMY的应用价值，更好地为医药领域做出贡献。