宫颈癌盆腔淋巴结转移生物标志物研究进展

巨宇叶，王雪，陈思璐，王晓慧

宫颈癌是女性的第二大恶性肿瘤，早期宫颈癌盆腔淋巴结转移患者约占15%～20%，淋巴结转移阳性患者的5年总生存率约为50%，而无淋巴结转移者生存率超过90%[1]。淋巴结转移情况与患者手术方式的选择及预后密切相关[2]。无淋巴结转移的宫颈癌患者接受广泛性淋巴结切除术会导致某些不必要相关并发症（如感染、神经损伤、淋巴囊肿形成、血管损伤、静脉血栓栓塞和下肢淋巴水肿等）的发生，影响患者生活质量。因此，准确的术前或术中盆腔淋巴结转移的评估是亟待解决的临床问题。随着宫颈癌淋巴结转移相关分子研究的不断深入，生物标志物的发现为术前及术中诊断提供了新的思路，特异性生物标志物检测可能成为术前及术中评估盆腔淋巴结转移的有效方法。本文就目前宫颈癌盆腔淋巴结转移相关热点上皮-间质转化（EMT）、血管内皮生长因子 C（VEGF-C）及微小 RNA（miRNA）为中心，对可能的生物标志物进行综述。

1 宫颈癌前哨淋巴结（SLN）转移相关生物标志物

SLN被认为是盆腔淋巴结区域转移扩散的第一站点。根据SLN假说，在早期宫颈癌SLN中未检测到转移时，可以省略淋巴结清扫。大多数SLN位于预期区域，但直径＞2 cm的肿瘤和肿瘤分期＞Ⅰb2期可影响早期宫颈癌的淋巴引流途径，淋巴管可能被癌细胞阻塞，导致肿瘤淋巴引流的改变。在盆腔淋巴结转移阳性时，若无法清除所有转移淋巴结，将导致患者治疗不足。细胞角蛋白（CK）是上皮细胞骨架系统的组成部分，具有严格的上皮特异性，在间叶组织中缺乏表达，常被用于检测淋巴结上皮性转移肿瘤。Samouëlian等[3]通过定量聚合酶链反应（PCR）检测21例宫颈癌患者术后病理组织潜在转移标志物mRNA的表达，结果显示CK19、人乳头瘤病毒（HPV）16-E6和黏蛋白1（MUC1）在淋巴结转移阳性的宫颈癌组织中表达明显高于淋巴结转移阴性者（P＜0.001），进一步分析表明CK19/HPV16-E6的生物标志物组合可支持实时术中检测新鲜宫颈癌组织中微小但可能致命的转移结节。基于HPV感染与宫颈癌进展的相关研究，Tortora等[4]使用广谱PCR技术检测宫颈癌癌旁组织和盆腔淋巴结中的HPV-DNA序列，从而评估分子PCR方法与组织学相比在鉴定早期转移癌细胞中的敏感性。结果显示，在所有组织学阳性的癌旁组织和淋巴结标本中均检出HPVDNA，另在16%（5/31）组织学阴性的癌旁组织和25%（68/182）组织学阴性的淋巴结中检出HPVDNA，但淋巴结及癌旁组织的HPV阳性率（46%vs.52%）差异无统计学意义，认为HPV-DNA可能是鉴别宫颈癌淋巴结微转移的敏感指标。Lu等[5]对宫颈癌患者SLN进行HPV-DNA定量检测，结果显示组织学阴性SLN的HPV-DNA中位检测水平为2.50（1.90～2.90）拷贝/ng，而组织学阳性SLN的HPVDNA 中位检测水平为 8.55（6.20～9.80）拷贝/ng（P＜0.001），提示定量HPV-DNA可能是一个有用的预测宫颈癌淋巴结转移情况的临床生物标志物。Köhler等[6]使用APTIMA检测54例HPV阳性宫颈癌患者的SLN，结果表明所有经病理证实的转移淋巴结均显示为HPV-E6/E7 mRNA阳性，敏感度为100%，特异度为96.4%，并指出与HPV-DNA检测较高的假阳性率相比，对mRNA进行检测更为有效，但该研究未纳入HPV阴性患者作为对照，相关结论有待进一步证实。SLN是目前宫颈癌盆腔淋巴结转移的研究热点，SLN微转移易被漏诊，但SLN转移阳性影响患者预后及复发情况。美国国立综合癌症网络（NCCN）指南推荐使用前哨淋巴结定位（SLNM）作为宫颈癌患者术中的淋巴结评估方法。目前研究报道的SLNM总检出率及双侧检出率分别为15%～100%和0～93%[7]，检出率差异可由多种原因导致，原发肿瘤直径＞2 cm时可能由于肿瘤堵塞或压迫淋巴通道导致检出率降低[8]，通过宫颈注射造影剂及微创手术可能与检出率增高有关[7]。综上，将SLNM与生物标志物检测相结合可能是进一步提高SLN转移检出率的有效方法。

2 VEGF-C与宫颈癌盆腔淋巴结转移

VEGF-C属于VEGF家族，其可以特异性地与淋巴管内皮细胞上的血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）结合以激活VEGFR-3，使VEGFR-3与配体结合引起细胞内酪氨酸自身磷酸化，进而激活下游信号传导通路，引起淋巴管内皮细胞的增殖和分化。VEGF-C是唯一具有淋巴管生成作用的因子。VEGF-C在组织中过表达会导致细胞正常信号传导控制失调，使细胞分裂失控而出现无限增殖现象，导致肿瘤发生并促进肿瘤进展。VEGF-C表达与宫颈癌盆腔淋巴结转移的相关性也受到研究者的广泛关注[9]。

环氧化酶2（COX-2）是前列腺素合成的重要限速酶，与炎症反应有关，可激活VEGF-C的表达，间接促进淋巴管新生。Liu等[10]对43例宫颈癌手术患者进行前瞻性研究并建立体外模型，验证了COX-2和VEGF-C在淋巴结转移阳性患者高表达，认为COX-2通过VEGF-C介导的淋巴管生成促进淋巴结转移，并提出前列腺素受体EP1和EP4可能参与了COX-2介导的VEGF-C蛋白和mRNA表达的调控。

Foxp3是一种转录因子，发挥转录激活和抑制特定基因的作用，并调节T细胞功能，在免疫抑制性肿瘤形成微环境的过程中起着重要作用。Tang等[11]检测了50例宫颈癌组织中Foxp3和VEGF-C的表达情况，发现淋巴结转移组Foxp3表达阳性率为87.5%（14/16），高于无淋巴结转移组（55.9%，19/34），当Foxp3和VEGF-C同时表达时患者出现最高的淋巴管密度，对淋巴结转移有一定预测价值。

趋化因子受体CXCR4通过刺激炎症反应促进细胞增殖，与其配体CXCL12的阳性表达被认为与实体瘤转移有关。Dai等[12]和於军等[13]对宫颈癌患者的肿瘤组织进行免疫组织化学分析，结果均显示CXCR4在淋巴转移阳性患者中的表达率为100%，但其表达情况与患者年龄、病理类型和分化程度无关。Dai等[12]进一步提出 CXCR4、CCR7、VEGF-C 和VEGF-D对宫颈癌淋巴结转移具有协同作用。VEGF-C对于淋巴管内皮细胞生成的促进作用使得其成为各实体肿瘤淋巴结转移的研究热点。

综上，与宫颈癌患者VEGF-C表达相关的分子对于宫颈癌淋巴结转移的诊断有一定的预测价值。此外，对于VEGF-C相关分子通路如蛋白激酶B（Akt）信号通路等及通路上下游分子的研究仍在不断增加，宫颈癌淋巴结转移生物标志物的选择也在增多。

3 EMT与宫颈癌盆腔淋巴结转移

EMT指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，E-钙黏蛋白表达的缺失是EMT的关键。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性和与基底膜之间的连接，而获得了较高的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力，促进肿瘤转移的发生、发展。EMT由一个调控网络在分子、细胞、组织、细胞环境等层面进行调节，随着其在肿瘤转移中的研究不断深入，发现Snail家族、E盒结合锌指蛋白（ZEB）及Twist等都是EMT相关转录因子，它们可通过 Wnts、Notch、核因子 κB（NF-κB）和低氧诱导因子（HIF）等多种信号通路诱导宫颈癌细胞发生EMT，促进宫颈癌迁移和侵袭，导致宫颈癌盆腔淋巴结转移的发生[14]。Sam68是RNA结合蛋白家族及RNA激活因子家族的信号转导子，使RNA与信号通路相联系，在RNA代谢中起着重要作用。Li等[15]研究发现Sam68与宫颈癌早期患者临床病理因素尤其是淋巴结转移有关，进一步体外实验发现Sam68的下调可能通过抑制Akt/GSK-3β/Snail途径逆转EMT而抑制细胞运动和侵袭，认为Sam68的表达谱具有作为宫颈癌患者盆腔淋巴结转移生物标志物的潜力。

Rab39a属于Ras蛋白超家族成员，Rab39a上调可抑制宫颈癌细胞发生EMT。Zou等[16]用Akt抑制剂阻断Akt信号转导后，发现用Rab39a特异性小干扰RNA（siRNA）阻断Rab39a的转染组与对照组宫颈癌细胞迁移和侵袭能力均下降但差异无统计学意义，认为Rab39a可能在宫颈癌细胞EMT进程中充当Akt信号通路的拮抗剂，从而抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。

脂钙蛋白2（Lipocalin2）是一种EMT相关的癌基因蛋白，Lipocalin2诱导的肿瘤细胞迁移受EMT相关蛋白、Snail、Twist、N-钙黏蛋白、纤维连接蛋白和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的激活[17]。Chung等[18]研究证明Lipocalin2通过EMT途径促进宫颈癌细胞转移，提出可将Lipocalin2作为宫颈癌淋巴结转移的标志物。微管相关蛋白7（MAP7）是维持微管结构和功能的必要成分，与细胞分裂、分化等过程密切相关，其在宫颈癌组织中表达明显增高。Zhang等[19]研究证明MAP7表达增加可通过EMT及自噬调节促进宫颈癌淋巴结转移的发生。此外，有研究显示浮舰蛋白1（Flotillin-1）、转导素β1X连锁受体蛋白1（TBLR1）及核仁纺锤体相关蛋白1（NUSAP1）通过抑制Wnt2/β连环蛋白（β-catenin）途径逆转了EMT的发生，减少了宫颈癌盆腔淋巴结转移[20-22]。高迁移率族蛋白A2（HMGA2）基因是一种染色质重构因子，可与DNA中AT富集的区域结合，在染色质结构中起调节作用，可增强或削弱转录增强子的功能，在胚胎发育早期主要在间充质中表达，对间充质的增殖和分化起调节作用，与EMT密切相关。ATR/Chk1信号通路主要调节DNA损伤修复。Wang等[23]研究证明，HMGA2通过沉默或抑制ATR/Chk1信号通路从而抑制EMT及裸鼠移植宫颈肿瘤后淋巴结转移。Ou等[24]研究首次验证了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通过激活SiHa细胞的Notch/Lox/Snail通路促进EMT的发生，从而增加宫颈癌细胞的转移能力。EMT对宫颈癌盆腔淋巴结转移有重要作用，各相关分子主要通过Wnt2/β-catenin及Akt途径调节EMT，影响宫颈癌淋巴结转移。与EMT相关的各分子可能成为有效的生物标志物，为淋巴结转移患者的诊断及治疗提供参考。

4 miRNA与宫颈癌盆腔淋巴结转移

4.1 循环miRNA表达与宫颈癌盆腔淋巴结转移 miRNA是一类由内源性基因编码的长度为20～24个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控。miRNA调控着人类1/3的基因，其中一部分参与生命发展的重要进程，包括细胞增殖、死亡和分化等，进而影响肿瘤淋巴结转移。目前已发现上百种与宫颈癌发生有关的miRNA[25]，对于宫颈癌淋巴结转移的研究也在不断增加。Chen等[26]提出循环miRNA可作为早期宫颈癌盆腔淋巴结转移的生物标志物，并检测淋巴结转移阴性及阳性患者各40例的循环miRNA表达情况，共89个miRNA被纳入研究，筛选后结果显示循环miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p 和 miR-4484的表达对淋巴结转移阳性患者有预测价值，联合6个循环miRNA预测淋巴结转移，敏感度为85.6%，特异度为85.0%，检测阈值为0.551；进一步与血清SCC抗原（SCC-Ag）对淋巴结转移的预测价值进行比较，显示血清miRNA明显优于血清SCC-Ag，但较治疗前活检癌组织miRNA（敏感度96.7%，特异度95.0%）预测价值低，建议可将循环/组织miRNA（miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p 和miR-4484）用于预测早期宫颈癌患者的淋巴结转移。Zhang等[27]对宫颈癌淋巴结转移阳性患者（22例）与淋巴结转移阴性患者（67例）循环miR-21的表达情况进行分析，结果表明淋巴结转移阳性患者循环miR-21表达水平高于淋巴结转移阴性者（P＜0.001），截断值为4.370；进一步的体外实验表明，miR-21表达增加与RAS基因诱导的EMT调节miR-21/Ras p21蛋白活化子1（RASA1）轴促进宫颈癌细胞迁移有关。循环miRNA的检测具有方便、无创及高稳定性等优点，特异性表达的miRNA作为生物标志物在宫颈癌术前诊断淋巴结转移中具有重要意义。

4.2 组织miRNA表达与宫颈癌盆腔淋巴结转移 目前对于宫颈癌盆腔淋巴结转移具有特异性诊断价值的miRNA仍需进一步探索。陈军莹等[28]检测早期宫颈鳞状细胞癌淋巴结转移患者治疗前活检癌组织中miRNA表达情况，从1 450个miRNA中筛选出24个在淋巴结转移阳性患者癌组织中差异表达的miRNA，其中 17个 miRNA 高表达（miR-1246、miR-1275、miR-1290、miR-17、miR-20a、miR-21、miR-2392、miR-3147、miR-3149、miR-3162-5p、miR-3934、miR-3945、miR-4433、miR-4484、miR-4492、miR-4667-5p和 miR-47），7个 miRNA 低表达（miR-100、miR-126、miR-141、miR-203、miR-34a、miR-4467和 miR-451）；4个 miRNA（miR-1246、miR-2392、miR-3149和miR-3162-5p）的曲线下面积（AUC）＞0.8，将这4个差异miRNA联合用于预测淋巴结转移情况，敏感度为90.0%，特异度93.3%。较Chen等[26]联合6个差异 miRNA（miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p 和 miR-4484）的敏感度（96.7%）、特异度（95.0%）稍低。Zhou等[29]检测了宫颈鳞状细胞癌淋巴结转移阳性患者组织miR-221-3p表达水平，结果显示其与淋巴结转移情况及瘤周淋巴管密度呈正相关；进一步研究证明癌细胞分泌的miR-221-3p可转移到淋巴细胞并靶向作用于VASH1，促进淋巴管生成和淋巴结转移，认为miR-221-3p可作为宫颈癌淋巴结转移新的诊断指标。Shang等[30]研究证明LNMICC通过与NPM1直接作用靶向FABP5启动子区域，从而介导脂肪酸代谢的重新编程，并最终促进宫颈癌的淋巴管生成和EMT过程，而miR-190可靶向抑制LNMICC的作用，进而抑制宫颈癌淋巴结转移。Zeng等[31]研究发现宫颈癌淋巴结转移阳性患者原发肿瘤组织中miR-10a明显高于无转移患者（P＜0.001），且miR-10a通过负调控抑癌基因第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）抑制宫颈癌淋巴结转移的发生，提示可将miR-10a作为宫颈癌淋巴结转移的预测分子。此外，还有众多miRNA被证明与宫颈癌淋巴结转移相关，如miR-218[32]、miR-211[33]、miR-374c-5p[34]及 miR-378[35]过表达可通过抑制EMT影响宫颈癌淋巴结转移的发生；hsamiR-508、hsa-miR-509-2和 hsa-miR-526b在淋巴结转移阳性患者中表达水平明显降低，且靶基因主要富集于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、环磷酸腺苷（cAMP）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路[36]；miR-141-3p[37]和miR-5047[38]表达增加可促进宫颈癌淋巴结转移，这些miRNA都有可能成为早期宫颈癌淋巴结转移的潜在诊断指标。综上所述，组织miRNA在宫颈癌盆腔淋巴结转移中具有较高的预测价值。miRNA作为生物标志物在宫颈癌中的应用，可提高术前及术中盆腔淋巴转移诊断的准确性。

5 结语

淋巴结转移是宫颈癌的主要转移途径，是一个多因素共同调节的复杂过程，研究证明大部分相关分子的表达常伴随EMT的发生或抑制，并且以Akt、Notch/Snail和Wnt2/β-catenin途径为主要调节通路，为宫颈癌淋巴结转移生物标志物的发现提供思路。术前或术中淋巴结转移的确定将为宫颈癌患者提供更加适宜的治疗方案。影像学检查对阳性淋巴结的检出有局限性，对于某些影像学表现与实际转移情况不一致的患者，特异性生物标志物的发现具有重要意义。