γ-干扰素释放试验假阴性影响因素研究进展

孙丹雄

云南省第一人民医院呼吸与危重症医学科,昆明650000

γ-干 扰 素 释 放 试 验 (interferon-γ release assays,IGRA)通过早期分泌抗原靶 (ESAT-6)和培养滤液蛋白(CFP-10)等特异性抗原 (有些产品还增加了TB7.7抗原多肽),体外刺激机体特异性效应T 淋巴细胞,然后检测γ-干扰素 (interfer on-γ,IFN-γ)水平或计数分泌IFN-γ的特异性T 淋巴细胞,从而判断是否存在结核感染。检测方法主要有两种： (1)采用酶联免疫吸附试验检测IFN-γ水平,商业产品主要是澳大利亚Cellestis 公司的QFT-GIT (Quanti FERON-TB Gold In-Tube)、QFT-G(QuantiFERON-TB Gold)以及QFT (QuantiFERON-TB)。(2)采用酶联免疫斑点试验检测并计数分泌IFN-γ的特异性T 淋巴细胞,商业产品主要是英国牛津Immunotech公司生产的T-SPOT.TB。ESAT-6 和CFP-10 主要存在于结核杆菌复合群,在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中缺失,所以IGRA 诊断结核感染的特异度明显高于PPD 试验,但是其不能区分活动性结核和潜伏性结核感染。有研究显示,在中、低收入国家以及结核病高负担地区不建议使用IGRA 来诊断活动性结核病。国内进行的一项大规模、多中心、回顾性研究显示,IGRA 诊断活动性肺结核的特异度仅为56.37%,在没有肺结核的肺病患者中T-SPOT.TB的阳性率高达43.6%。由此可见,在结核病高负担国家,IGRA 的临床价值更在于利用其阴性结果并结合其他临床表现来进一步排除活动性结核感染。但诸多研究显示,很多因素会造成IGRA 假阴性[1-2],临床上应注意综合分析。本文就IGRA 假阴性的原因及相关机制作一综述。

1 患者的全身状态

1.1 年龄 大多数研究均显示,年龄是IGRA 假阴性的独立影响因素,特别是对于成年人,随着年龄的增长,假阴性逐渐增多。欧洲肺结核网络实验小组进行了一项国际多中心横断面回顾性研究 (TBNET 研究)[3],来自25 个研究中心的664例经结核杆菌培养和/或结核杆菌特异性核酸检测确诊的活动性结核病患者纳入分析,Logistic回归分析显示,年龄是QFT-GIT 假阴性的唯一显著变量 (OR=1.04,95%CI：1.02～1.07,P<0.01)。其机制可能是随着年龄增长,ESAT-6或CFP-10引起的IFN-γ浓度逐渐减少,从而出现假阴性。在儿童患者中,年龄与假阴性的关系不明确。有学者研究发现年轻儿童的IGRA 假阴性结果发生率更高[4],但Velasco-Arnaiz等[5]的研究则显示对于5岁以下的儿童,年龄与抗原刺激引起的IFN-γ反应之间没有相关性。

1.2 营养状态 有研究显示,体质量指数过高、过低均与IGRA 假阴性相关。Matsushita等[6]研究发现低体质量指数在假阴性QFT-IT 患者中更常见。Hang等[7]研究显示消瘦 (体质量指数<16.0 kg/m2)与IGRA 假阴性显著相关(OR=5.42,95%CI：1.48～19.79)。Pan 等[8]的研究则显示超重 (体质量指数≥25 kg/m2,OR=2.43,95%CI：1.05～5.63)是假阴性T-SPOT.TB的独立危险因素。国内有研究发现低蛋白血症对IGRA 的检测结果没有影响[9]。营养状态与IGRA 假阴性的关系及相关机制有待进一步研究。

1.3 等位基因和种族 少数研究发现等位基因和种族与IGRA 假阴性相关。Hang等[7]对543例新诊断的涂片阳性肺结核患者进行研究,Logistic回归分析显示,患者所携带的HLA-DRB1*0701等位基因数目增加与QFT-GIT 假阴性显著相关 (OR=5.09,95%CI：2.31～11.22),其机制可能是HLA-DRB1*0701等位基因的遗传变异性可引起ESAT-6和CFP-10的结合减少,当抗原较少提呈给T 细胞时,可能会出现免疫反应失效,IFN-γ 浓度减少。Matsushita等[6]在后来的研究中也发现HLA-DRB1*0701等位基因在QFT-GIT 假阴性的肺结核患者中更常见。Nguyen等[10]对1 527例培养确诊的结核病患者进行研究,多变量分析显示非西班牙裔白人/种族与IGRA (包括QFT-GIT 及T-SPOT.TB)假阴性相关。

2 基础疾病与免疫功能

2.1 人类免疫缺陷病毒 (hu man i mmunodeficiency vir us,HIV)感染 诸多研究发现HIV 感染与IGRA 假阴性密切相关,HIV 阳性患者的敏感度显著降低。Hang等[7]研究显示合并HIV感染是IGRA假阴性的独立危险因素(OR=6.38,95%CI：1.78～22.92)。HIV 患者假阴性结果增加可能与其低水平的CD4+T 淋巴细胞计数有关[11-12]。

2.2 糖尿病 目前,糖尿病与IGRA 假阴性的关系仍不明确。有学者研究发现严重的糖尿病会导致IGRA 假阴性,空腹血糖水平升高与结核杆菌特异性IFN-γ 水平呈负相关[12-13]。但 也 有 研 究 显 示, 不 管 是 QFT-IT 还 是T-SPOT.TB,糖尿病均与假阴性无关[14]。国内学者Yang等[15]进行的研究也显示糖尿病不是假阴性T-SPOT.TB检测结果的显著预测因素。

2.3 恶性肿瘤 恶性肿瘤与IGRA 假阴性的关系亦不明确。Kwon等[16]进行一项多中心回顾性队列研究显示,合并恶性肿瘤与QFT-GIT 假阴性显著相关 (OR=2.42,95%CI：1.30～4.49)。但国内学者Yang等[15]进行的大样本回顾性研究则显示,合并恶性肿瘤不是T-SPOT-TB假阴性结果的显著预测因素。

2.4 淋巴细胞 很多研究发现IGRA 受CD4+T 细胞免疫缺陷的影响[17]。Kwon 等[16]研究发现,QFT-GIT 假阴性结果与淋巴细胞高度相关 (淋巴细胞总数<1.0×109/L,OR=1.86,95%CI：1.21～2.87)。但在Syed Aha med Kabeer等[18]的研究中,Logistic回归分析显示QFT-G 假阴性与CD4+T 淋巴细胞计数无关,不过在CD4+计数<200个/μl的个体中更容易出现不确定结果。淋巴细胞与IGRA 假阴性的关系争议颇多,有待进一步研究,国内学者Yang等[15]进行的大样本研究也显示,T-SPOT.TB假阴性与CD4+T 淋巴细胞计数及血淋巴细胞绝对值均无关系。

2.5 药物 影响机体免疫功能的药物可能会导致IGRA 假阴性。Keystone等[19]研究发现,炎症性疾病 (类风湿关节炎、脊柱炎或克罗恩病)患者经过14周抗肿瘤坏死因子α治疗及CFP-10 刺激后,既往患肺结核的患者释放IFN-γ的CD4+T 淋巴细胞减少。Lai等[20]研究发现,类固醇的使用在假阴性IGRA 患者中更常见。

目前,基础疾病及免疫功能低下与IGRA 假阴性的关系仍不明确。在TBNET 研究[3]中,免疫功能低下 (至少存在以下一种：HIV 感染,免疫抑制药物治疗,糖尿病,类风湿性关节炎,恶性肿瘤和/或实体器官或干细胞移植史)不是假阴性IGRA (包括QFT-GIT 及T-SPOT.TB)的危险因素。

3 炎症指标

Kwon等[16]研究发现C-反应蛋白是QFT-GIT 假阴性结果的预测因素,且QFT-GIT 假阴性和不确定结果的概率随着C-反应蛋白水平的升高而增加。但Yang等[15]的研究则显示C-反应蛋白、ESR 等均与T-SPOT.TB假阴性无关。炎症指标在IGRA 假阴性中的预测价值有待商榷。

4 结核病情

4.1 病程 结核病的病程与IGRA 假阴性可能有关。Pan等[8]对肺结核进行研究,多变量分析显示,患者住院前的较长病程 (>6个月,OR=2.46,95%CI：1.24～4.92)是假阴性T-SPOT.TB的独立危险因素。

4.2 痰菌情况 痰菌阴性的患者可能更容易出现IGRA 假阴性。国内学者Yang等[15]对4 964例患者 (2 425例活动性结核病,2 539例非结核病呼吸道疾病)进行回顾性研究,Logistic回归分析显示痰抗酸杆菌涂片阴性 (OR=1.821,95%CI：1.338～2.477)、分枝杆菌培养阴性 (OR=1.379,95%CI：1.043～1.824)与T-SPOT.TB假阴性增加有关,机制不详。

4.3 合并肺外结核 国内学者Yang等[15]研究发现,未合并肺外结核会增加T-SPOT.TB的假阴性 (OR=1.291,95%CI：1.026～1.623)。但Syed Aha med Kabeer等[18]的研究则显示,与肺结核相比,肺外结核患者QFT-G 的敏感度并不逊色。TBNET 研究[3]也显示,肺外结核不是假阴性IGRA 的影响因素。由此可见,肺外结核并不一定会增加IGRA 假阴性发生率。

4.4 肺结核病变范围 肺结核的病变范围与IGRA 假阴性可能有一定关系。Kwon等[16]进行一项多中心回顾性队列研究,1 264例培养确诊的成年结核病患者纳入研究,胸部影像学显示双侧病变 (OR=1.75,95%CI：1.13～2.72)与QFT-GIT 假阴性显著相关。

4.5 结核的治疗情况 抗结核治疗病情好转,部分患者IGRA 结果会出现转阴的情况。有研究发现,IFN-γ的定量水平在治疗期间逐渐下降,特别是在活动性结核病中,其机制不详,可能与抗原负荷减少有关[21]。Lee等[22]对59例免疫功能正常的新诊断为活动性结核病的士兵进行研究,抗结核治疗前以及治疗后的第1、3、6个月QFT-GIT 的阳性率分别为96.6%、89.8%、71.2%、66.1%,IFN-γ 水平则分别为 (5.31±5.34)、 (3.95±4.30)、 (1.82±2.14)、(1.50±2.12)IU/ml,均随着治疗时间的延长而逐渐降低。Par k等[23]研究发现,抗结核治疗后T-SPOT.TB定量分析结果显著下降。抗结核治疗与IGRA 结果的关系比较复杂,具体的影响情况尚不清楚,目前争议较多。有学者报道,儿童患者在治疗的第1个月中表现为对ESAT-6的反应增加,随后对ESAT-6 和CFP-10 的反应逐渐减少[24]。在Matsushita等[6]的研究中,19例QFT-IT 阴性的肺结核患者 (涂片阳性或经培养证实)中有8例在抗结核治疗后 (第2个月或第7个月)反而转为阳性。TBNET 研究[3]则显示,抗结核治疗不是假阴性IGRA 试验结果的危险因素。国内也有研究显示,结核化疗不是导致治疗前后IFN-γ水平变化的主要原因[25]。

5 检测方法及影响因素

5.1 检测方法 检测方法与IGRA 假阴性可能也有一定关系,但争议颇多。Lai等[20]等研究发现,与T-SPOT.TB相比,QFT-GIT 更容易导致假阴性和不确定结果,尤其是在免疫功能低下的患者中 (恶性肿瘤、糖尿病和使用类固醇等)。在TBNET 研究[3]中,年龄是QFT-GIT 假阴性的唯一显著变量,但不是T-SPOT.TB假阴性的预测因子,其机制可能是随着年龄增长,ESAT-6或CFP-10引起的IFN-γ浓度逐渐减少,T-SPOT.TB需要特定数量的外周血单核细胞,即使较少量的IFN-γ也可检测到,但QFT-GIT 使用全血而没有任何单核细胞数量的标准化,年龄增长引起的IFN-γ浓度减少导致了假阴性结果的出现。Nguyen等[10]的研究则相反,T-SPOT.TB检测与IGRA 假阴性相关 (校正OR=1.58,95%CI：1.12～2.24)。另外,Wang 等[26]研究则显示,对于活动性结核病的诊断,IGRA-ELISA 与T-SPOT.TB在敏感度方面并无差异。

5.2 检测影响因素 IFN-γ的释放受多种因素的影响。有学者通过酶联免疫斑点法检测到IFN-γ可能存在自发释放现象,导致检测结果不可避免的出现各种偏差[27]。Tebr uegge等[28]对英国伦敦一家大型诊断服务提供商进行的31 932次QFT-GIT 结果进行分析发现,不确定结果的比例在秋季 (8.2%)显著高于春季 (6.2%,P<0.000 1)、夏季 (4.8%,P<0.000 1)和冬季 (6.2%,P<0.000 1),提示季节引起的宿主和环境因素也有可能影响检测结果。

6 吸烟

Altet等[29]对175例活动性肺结核患者和350例来自接触者追踪研究的患者进行研究,Logistic回归分析显示吸烟是IGRA 假阴性的主要因素 (校正OR=3.35,95%CI：1.47～7.61,P<0.05),非吸烟者的IFN-γ应答明显高于吸烟者,吸烟可直接引起IFN-γ 反应减弱,且吸烟量和IFN-γ反应呈剂量依赖性。但TBNET 研究[3]中,吸烟不是假阴性IGRA 试验结果的危险因素。吸烟与IGRA 的关系有待更多的研究证实。

IGRA 存在着不可避免的假阴性结果,因为其临界值是在与健康对照的研究中人为划定的最佳临界值,而诊断活动性结核的定量界值则是在与未合并活动性结核的患者的对照研究中根据最大约登指数计算出来的,倘若为减少假阴性而升高敏感度,则不可避免地造成特异度下降[30]。IGRA 通过检测IFN-γ水平判断结核感染,但人体免疫系统极其复杂,任何影响免疫功能的因素都可能或多或少的影响到IFN-γ的释放,由此推测IGRA 的影响因素众多,每个因素的影响程度大小各异,这就造成了在不同的研究中,研究对象很难同质化,研究结果也不尽相同甚至相反。另外,IGRA 的操作过程复杂,对操作者的要求较高,检测过程中任何不规范行为以及标本采集过程中存在任何差错,均可能导致结果不准确。

综上所述,年龄增长、HIV 感染、抗结核治疗等可导致IGRA 假阴性。另外,患者的营养状态 (体质量指数)、等位基因及种族等亦可能导致IGRA 假阴性,合并糖尿病及恶性肿瘤、淋巴细胞下降、结核的病程、痰菌阴性、合并肺外结核、肺部病灶范围较广、吸烟、检测方法及环境、影响免疫功能药物的使用等均可能造成IGRA 假阴性,但争议颇多,有待更多的研究进一步证实。在实际临床工作中,遇到IGRA 阴性结果不可轻易排除结核感染,需要考虑到年龄、合并症、抗结核治疗、营养状态以及免疫功能等各种可能导致假阴性的影响因素,结合患者的临床表现综合分析。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突