川崎病诊断相关生物学标志物的研究现状及进展

王 亮 司 萍综述 沈永明审校

天津市儿童医院检验科（天津 300074）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种常见的儿童全身性血管炎综合征，多见于5 岁以下婴幼儿，目前发病率最高的是日本、韩国和台湾[1]。KD 的典型临床表现有发热、皮疹、黏膜炎以及心血管损伤等冠状动脉损伤（coronary artery lesions，CAL）。KD 可累及冠状动脉，引起冠状动脉扩张、心肌炎、血栓形成，若得不到及时治疗，严重者可导致死亡。目前KD 的诊断主要依据临床症状，但易与其他一些儿童自愈性疾病相混淆，包括麻疹、腺病毒感染、猩红热、登革热。如果KD 的临床表现不明显，特别是不完全性KD，容易发生漏检。静脉注射丙种球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）已成为指南推荐的KD治疗 首选方案，但大约10%～20%的患儿在单次IVIG 后无反应，而IVIG无反应型KD发生CAL的风险更 高[2]。目前KD病因尚不清楚，普遍认为与感染、免疫，细胞因子损伤及遗传易感性等多种因素相关。本文重点介绍KD 诊断相关生物学标志物的研究现状，并叙述其在疾病诊断和评估疾病严重程度中的作用。

1 炎症标志物

KD 患者的炎症标志物水平随疾病进展发生变化。研究报道，KD急性期患者的红细胞沉降率、血小板数升高，并且急性期有白细胞数、中性粒细胞数增多，其程度与心功能不全有关[3]。C反应蛋白作为炎症标志物，与KD疾病严重程度和CAL的发展也有显著关系。KD患儿处于急性期时C反应蛋白显著升高，当炎症得到控制后其含量又会降低，有可能作为疾病治疗和预后观察的指标。研究发现，降钙素原水平在KD急性期升高，并且IVIG无反应型KD患儿升高更加明显[4]。外周血嗜酸性粒细胞增多和低白蛋白与 IVIG无反应以及冠状动脉并发症的风险增加有关[5-6]。平均血小板体积、血小板分布宽度降低和血小板衍生微 粒已被证明是KD急性期血小板活化和炎症的标志[7-8]。炎症标志物在很大程度上是非特异性的，因为这些标志物在许多其他炎症和感染条件下也会升高。这些生物标志物可以反映KD 机体持续的炎症状态，但在作出明确诊断方面仍作用有限。

2 免疫标志物

树突状细胞（dendritic cells，DCs）作为最强的抗原提呈细胞，是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁，其细胞数的动态变化会引起机体免疫状态变化。研究报道，在KD急性期外周血中髓细胞型DCs水平升高，而浆细胞型DCs 升高不明显[9]，这提示KD 患儿可能存在免疫耐受。KD急性期CD8+T细胞数量减少，但早期T细胞活化标志CD8+CD69+T细胞增加，晚期T细胞活化标志CD 8+HLA-DR+T 细胞未见明显增加，CD8+CD69+T细胞可作为病情进展的指标[10]。KD动物模型的冠状动脉免疫组织化学研究表明，CD8+T细胞存在于受损的冠状动脉内，并且与炎症性血管炎有关[11]。研究发现，CD8+T细胞活化和抑制失衡可能与KD发病机制相关，IVIG抑制CD8+T细胞的活化，但CD8+T细胞的过度激活可能引起IVIG无反应，CD8+HLA-DR+T细胞/CD8+CD69+T细胞比值可作为预测IVIG 敏感性的指标[12]。急性期KD 患儿存在明显的辅助性T 细胞17(Th 17)和调节性T 细胞（Treg）失衡[13]，Th17比例上调，而Treg比例下调。这些结果提示KD患者机体存在免疫系统失衡，特别是CD8相关免疫系统，进而导致机体免疫功能紊乱。

近年来，关于KD 急性期的促炎和抗炎细胞因子的研究多有报道。研究发现，血浆中细胞因子IL-17，IL-23以及Th1/Th2细胞因子，包括IFNγ、IL-10、IL-6、IL-4 在KD 急性期均有升高[13-14]，并且血浆中Th1/Th2 细胞因子可用于疾病诊断和治疗效果评价。血管内皮生长因子、IL-6是KD发生CAL的重要危险因素[15]。急性期KD 患儿sCD 40 L、E-选择素、CCL 23、CXCL 10 表达均高于对照组[16]。肿瘤坏死因子（TNF-α）在招募炎症细胞到冠状动脉内皮的过程以及CAL发生发展中发挥重要作用。目前TNF-α阻断剂应用于KD的治疗也得到广泛研究[17]。这些研究可以为KD 疾病诊断提供生物标记物，同时也提示KD 机体存在某些级联反应，由于机体免疫功能异常，可能导致KD急性期的炎症上调以及IVIG无反应。

3 蛋白标志物

3.1 氨基末端脑钠肽前体

氨基末端脑钠肽前体（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）是一种无生物活性的肽段，是由心室肌细胞分泌的脑钠肽前体降解而成的，是心肌细胞应激的标志。急性期KD 患儿存在心肌损害，因此NT-proBNP 作为一种潜在的生物标志物得 到广泛研究。Meta分析发现，NT-proBNP截断值为190 pg/mL和260 pg/mL时，诊断KD的灵敏度为89%和93%，特异度为0.69和0.88[18]。而NT-proBNP截断值为1 300 pg/mL，诊断KD患儿CAL的灵敏度和特异度分别为95%和85%，NT-proBNP截断值为800 pg/mL，诊断KD 患儿IVIG 无反应的灵敏度和特异度分别为71%和62%[19]。NT-proBNP截断值为1025 pg/mL，诊断急性期KD 灵敏度为88%，特异度为96%[20]。根据患儿年龄不同而设定不同的NT-proBNP 界值，发现NT-proBNP 在不同年龄段中诊断的特异度和灵敏度存在差异[21]。但目前对依据年龄来确定界值仍存在争议，因为血清NT-proBNP 水平存在一定的年龄依赖性，一般在婴幼儿期最高，之后降低。此外应用NTproBNP诊断KD时，必须首先排除其他心脏疾病的存在，因为其他心脏疾病患者中也存在NT-proBNP水平增加[22]。

3.2 其他KD相关蛋白标志物

凝血酶致敏蛋白（thrombospondin，TSP）是首次从凝血酶刺激后的血小板细胞膜中分离的糖蛋白，但此后研究证实，体内多种细胞均可产生TSP。TSP包含5种亚型，其中TSP-2与KD关系得到广泛关注。研究发现，KD急性期血浆TSP-2水平明显升高，而在IVIG无反应型KD 患儿血浆中TSP 水平更高。当TSP-2 的截断值为31.50 ng/mL时，其预测IVIG无反应的灵敏度为82.35%，特异性度64.81%[23]。骨膜蛋白（periostin）是一种调节心血管损伤反应的基质细胞蛋白，与其他发热患儿相比，KD 急性期和慢性期患儿冠状动脉中骨膜蛋白含量增加[24]。可溶性生长刺激表达基因2蛋白（suppression of tumorigenicity-2，ST2）主要以2种亚型存在，跨膜或细胞形式的ST2（ST2L）以及可溶性或循环形式的ST2（sST2），可反映心血管应激和心肌纤维化。研究发现，sST2在KD急性期升高，其水平与心肌舒张功能受损有关；此外KD急性期患儿心肌肌钙蛋白I 水平显著升高，提示心肌细胞应激反应和细胞死亡与急性期KD患儿的心肌炎症有关[25]。研究发现，KD急性期患儿体内诱导型一氧化氮合酶（nitric oxide synthases，iNOS）、硫化氢（H2S）水平较对照组明显升高，但有CAL的KD患儿的iNOS表达水平明显高于无CAL的KD患儿，而H2S与之相反，联合应用i-NOS（＞10 U/mL）和H2S（＜3.31 μmol/L）预测冠状动脉扩张的灵敏度为80%，特异度为81%，因此有可能用于指导临床治疗，预防CAL的发生[26]。簇蛋白（clusterin）是高密度脂蛋白的一部分，对于维持冠状动脉壁的完整性发挥着重要作用。研究发现，KD患儿血浆簇蛋白＜12 mg/L与CAL发生发展相关[27]。细胞粘合素C（tenascin-C，TN-C）是近年来发现的新型细胞外基质成分之一，是组织损伤和炎症的标志。研究发现，KD急性期TN-C表达水平与心血管炎症程度相关[28]。

目前已知报道的KD相关的几种蛋白质生物标志物仍处于早期发现阶段，并且大多数研究结果是建立在单个中心的小样本研究对象之上，需要在更大的人群进行验证，才能将其应用于临床。此外NT-proBNP被认为是可进行床旁KD 诊断的理想指标。但KD 可能与其他伴有心功能障碍的发热疾病相混淆。因此NT-proBNP用于KD诊断时，必须首先排除其他心脏相关疾病。

4 KD易感基因

日本、韩国和中国台湾的KD 的发病率高于西方国家。这种差异提示遗传易感性，或反映环境或生活方式的差异。同时，亚洲人群中KD 患儿的同胞和有过KD病史的父母的后代的KD发病率分别是普通人群的6～10倍和2倍[29]。研究发现，在夏威夷定居的日本裔美国人中，KD 的发病率与日本本地的发病率相当，进一步指向KD 可能的遗传关联[30]。因此KD 可能是一种多基因复杂性疾病，随着与KD 相关的易感基因的研究，为KD的诊断提供了新的方向。

4.1 CD40基因

CD40是相对分子量质量48 000的细胞表面受体，其基因定位于20 q 11，属神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体超家族。CD 40-CD 40 L 配基化参与炎症反应过程。与发热对照组相比，KD 患儿CD 4+T 细胞上CD 40配体的表达水平较高。这种过度表达在IVIG治疗后下降[31]，这意味着CD 40-CD 40 L 相互作用可能参与KD 的冠脉炎症改变。目前CD 40基因是与KD发生相关的全基因组关联分析研究（genome-wide association study，GWAS）连锁的基因位点之一。GWAS分析显示，CD 40的功能性单核苷酸多态位点（ainge nucleotide polymorphisms，SNP）与KD的发病相关，其中汉族人群中发现CD 40基因SNP 位点（rs 4813003、rs1535045）与KD的易感性相关[32]。

4.2 1,4,5 三磷酸肌醇3 激酶C（inositol 1,4,5-triphosphate 3-kinase C，ITPKC） 基因

ITPKC基因定位于19q13.2，是Ca2+/NFAT信号通路的第二信使分子，在免疫活化和T 细胞受体信号传导过程中发挥重要作用。ITPKC多态性影响T细胞活化，可能导致炎症性T 细胞在急性期持续作用。GWAS 分析显示，ITPKC基因的单核苷酸多态性与KD 易感性相关，ITPKC基因功能性SNP rs 28493229的C等位基因可能增加KD的发生风险[33]。ITPKC中的SNP rs7251246与KD严重程度相关，并与CAL发生有显著关联[34]。然而，也有研究报道，ITPKC基因功能性SNP rs28493229与台湾地区KD发生风险之间没有显著关联[35]。

4.3 Fcγ受体ⅡA基因

Fcγ 受体ⅡA（Fc fragment of IgG receptor 2 A，FCGR2A）基因定位于人类染色体1q22-23，其编码的Fc段受体主要表达于免疫细胞膜表面，其多态性可以改变FcγRⅡa与lgG的结合力。研究发现，KD急性期患儿FCGR2A mRNA表达明显高于对照组[36]。GWAS分析显示，FCGR 2 A基因与KD 易感性相关，其中FCGR 2 A基因SNP rs 1801274 与KD 易感性相关。此外研究发现，FCGR2A基因SNP rsl801274与男性KD显著相关，而与女性相关性并不明显，这也可以进一步解释男性KD 发病率高于女性[37]。此外，FCGR 2 A基因H131R多态性可能与亚洲人的KD易感性有关[38]。

4.4 其他KD相关易感基因

除上述研究较广泛的KD 易感性相关基因外，一些其他基因也引起研究者的关注。CASP 3基因定位于人类染色体4 q 35，与细胞凋亡密切相关。已知报道CASP3基因SNP rs 72689236与KD易感性相关[39]。而ITPKC基因SNP rs28493229以及CASP3基因SNP rs113420705与IVIG无反应和CAL风险增加相关[40]。TGF-β 信号通路在炎症、T 细胞活化和组织重塑中发挥重要作用。研究报道，KD 患儿TGF-BR 2 mRNA表达明显高于健康对照组[41]。TGF-BR 2基因SNP rs6550004与KD易感性相关，SNP rs1495592与CAL相关[42]。B淋巴酪氨酸激酶（B lymphoid tyrosine kinase，BLK）在B细胞的信号转导中起作用。研究报道，朝鲜族人群中BLK基因SNP rs6993775与KD易感性相关[43]。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）主要存在于细胞膜表面。近期研究发现，HLA相关基因（HLA-CSNP rs9380242，HLA-BSNP rs9378199，MICA SNPrs9266669 和HCP5SNP rs6938467 ）与KD易感性显著相关[44]。

综上，目前关于KD 诊断相关生物学标志物的研究取得了显著进展。炎症标志物可以帮助用于KD的临床诊断，但这些标志物对KD 的诊断特异性较低。蛋白质组学研究已经确定了一些与KD相关的蛋白生物标志物，但这些生物标记物仍需进一步开展多中心大样本临床研究才能用于诊断KD。全基因组关联研究为KD 诊断提供新的研究方向，但研究处于发展的早期阶段，需要在不同人群中进行大规模验证，尚不足以作为KD 诊断的标准，但对于研究KD 的发病机制以及精准治疗提供新的思路。