铁皮石斛叶的化学成分研究*

张春花 徐巧林 曾 雷 王 颂 罗青文,3 陈颖乐

(1. 广东省林业科技推广总站，广东 广州 510173；2. 广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院， 广东 广州 510520；3. 中国科学院华南植物园，广东 广州 510650 )

铁皮石斛 (Dendrobium officinale)系兰科石斛属多年生附生草本植物，是我国珍稀名贵中草药和民间保健食品，具有益胃生津，滋阴清热等功效[1]。由于其全面的滋阴补益作用和广泛的保健功效[2]，铁皮石斛被越来越多的消费者所熟知和认可，市场需求日益增长[3]，具有较大的发展潜力。传统上，铁皮石斛以茎入药，新鲜茎秆可直接食用，或加工成铁皮枫斗用于炖汤、泡茶或浸酒等[4]。铁皮石斛茎是目前主要的应用开发对象，目前市场上有铁皮石斛鲜条、铁皮枫斗、铁皮石斛酒、面膜等一系列产品。

茎部作为铁皮石斛传统的药用部位，近年来对其化学成分已有一定研究，目前已从中鉴定了190 种化学成分，除挥发性成分外，主要包括多糖、芪类、苯酚类、脂类、糖和糖苷、生物碱和其他化合物等[5]，部分化合物具有护肝、抗肿瘤等重要生物活性。铁皮石斛叶的生物量大，产量仅次于茎，每年可达上千吨，但是由于缺乏针对其化学成分与药理功效的系统研究，对其功能价值认识不足，未能有效开发利用，部分地区将其作为饲料或者直接丢弃，造成了资源的极大浪费。为进一步开发利用铁皮石斛叶的化学资源，作者对铁皮石斛叶的化学成分进行了研究，从其乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部共分离得到12 个化合物，对其波谱数据进行分析，分别鉴定为4-羟基苯乙酮(1)、对羟基苯甲醛(2)、丁香醛(3)、α-萘酚(4)、香草酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 (5)、5-羟甲 基 糠 醛 (6)、(3S,5R,6R,7E,9S)-3,5,6,9-tetrahydroxy- 7-megastigmene (7)、(6R,9S)-9-hydroxymegastigma-4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside (8)、(3R,9R)-9-O-β-D-glucopyranosyl- 3-hydroxy-7,8-didehydro-β-ionol (9)、cyclomargenol (10)、N-p-香豆酰酪胺 (11)、肌苷 (inosine, 12)。化合物4、5、7、8、9、10 为首次从石斛属中分离获得，化合物1、2、6、12 为首次自铁皮石斛植物中分离获得。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛叶由云南省石斛种植公司提供，材料采摘自当地石斛种植基地并晾干保存，材料由中国科学院华南植物园段俊研究员鉴定。提取用酒精为95%工业乙醇；实验中所用试剂(氯仿、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、硫酸、盐酸等)为广州试剂二厂和天津富宇试剂公司生产，均为分析纯；各种氘代试剂均为美国sigma公司生产。柱色谱正相层析硅胶为青岛海洋化工有 限 公 司 产 品(80～100 目，200～300 目)；反 相层 析 硅 胶YMC ODS-A (50 μm) 为 日 本YMC 公司生产；薄层色谱正相硅胶板(HFGF254)为山东烟台江友硅胶开发有限公司产品；凝胶Sephadex LH-20 为瑞典Amersham Biosciences 公司产品。

1.2 仪器

高效液相半制备使用北京创新通恒科技有限公司的HPLC 半制备系统，泵型号为P3000，检测器为UV3000UV-VIS，色谱柱为Fuji-C18 (10 μm～100 A)；HPLC 采 用 日 本 岛 津 公 司LC-20AT 型液相色谱仪、SPD-M20A 检测器和Shim-Pack PRC-ODS 色 谱 柱 (粒 径5 μm, 孔 径12 nm, 250 mm × 20 mm)；减压浓缩采用日本东京理化公司N-1000 旋转蒸发仪、CCA-1110 循环式冷却箱和SB-1000 电热恒温水浴锅；反相色谱柱 (400 mm × 25 mm, 500 mm × 50 mm, 50 μm)；电喷雾质谱 (ESI-MS) MDS SCIEX API 2000LC/MS/MS 仪，以甲醇为溶剂，直接进样测定；1H NMR谱和13C NMR 谱采用Bruker DRX-500 核磁共振仪，并以四甲基硅烷为内标测定；比旋光度用Perkin-Elmer 341 旋光仪测定。

1.3 提取和分离

铁皮石斛叶 (干重11.0 kg)粉碎后用95%乙醇浸提4 次，每次3 天，合并提取液；经减压浓缩除去乙醇后加适量水使其成为混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3 次；减压浓缩后分别得到石油醚萃取部 (715.0 g)、乙酸乙酯萃取部 (130.0 g)以及正丁醇萃取部 (456.0 g)。

铁皮石斛叶乙酸乙酯部LE (130.0g)经硅胶柱层析 (200～300 目)，依次以氯仿-甲醇 (100:1, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 0:100)梯度洗脱，经TLC 薄层层析检测合并主点相同的流分，得到LE1～LE10共10 个组分。LE2以石油醚:乙酸乙酯= 80:1 洗脱回收，经Sephadex LH-20 凝胶柱 (氯仿/甲醇=1/4)分离纯化，得到化合物10 (8.6 mg)。LE3经反相中压柱(ODS)层析分离纯化，依次以甲醇/ 水(25:75, 45:55, 55:45, 65:35, 85:15, 100:0)为流动相梯度洗脱，得到8 个亚组分。其中，LE3-4经Sephadex LH-20 凝 胶 柱 ( 氯 仿/ 甲 醇= 1/4、氯仿/甲醇=1/1)分离纯化，经TLC 薄层层析检测合并主点相同的流分；LE3-4-3用HPLC 制备，以乙腈/水 (18:82)为流动相等度洗脱，得到化合物6 (13.5 mg)；LE3-4-4用HPLC 制备，以甲醇/水(25:75 → 80:20)为流动相梯度洗脱，再反复经Sephadex LH-20 凝胶柱 (氯仿/甲醇=1/4)分离纯化，分别得到化合物3 (2.8 mg)、1 (2.2 mg)、2 (3.7 mg)；LE3-7经Sephadex LH-20 凝 胶 柱 ( 氯仿/甲醇=1/4)分离纯化，依次经石油醚:丙酮= 5:1、二氯甲烷:甲醇=2:1、石油醚:丙酮=100:1洗脱，得到化合物4 (2.2 mg)；LE4反复经Sephadex LH-20 凝胶柱 (氯仿/甲醇=1/4、氯仿/甲醇= 1/1)分离纯化，得到化合物11 (2.6 mg)。LE6经反相中压柱 (ODS)层析分离纯化，依次以甲醇/水(20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 75:25, 100:0)为流动相梯度洗脱，经TLC 薄层层析检测合并主点相同的流分，收集洗脱液得到6 个亚组份。LE6-2反复经Sephadex LH-20 凝胶柱 (氯仿/甲醇=1/4)分离纯化，经TLC 薄层层析检测合并。LE6-2-1以氯仿:甲醇=85:15 洗脱，得到化合物5 (3.7 mg)，化合物7 (3.0 mg)；LE6-2-2以石油醚:丙酮=10:1 洗脱，得到化合物12 (4.8 mg)；LE6-5经Sephadex LH-20 凝胶柱 (氯仿/甲醇=1/4)分离纯化，用HPLC 制备，以甲醇/水(35：65)为流动相等度洗脱，得到化合物9 (5.9 mg)和化合物8 (4.1 mg)。

1.4 结构鉴定

4-羟基苯乙酮 (4-Hydroxy acetopenone, 1) 无色粉末, 分子式为C8H8O2；ESI-MS m/z: 135 [MH]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD): δ 7.89 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2,6), 6.84 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3,5), 2.53 (3H, s);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 199.6 (C-7), 164.5 (C-4), 132.3 (C-2,6), 130.2 (C-1), 116.5 (C-3,5), 26.4 (C-8)。上述光谱数据与文献[6]报道的基本一致，故确定该化合物为4-羟基苯乙酮。

对羟基苯甲醛 (p-Hydroxy benzaldehyde, 2) 白 色 粉 末， 分 子 式 为C7H6O2；ESI-MS m/z：245 [2M+H]+, 121 [M-H]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 9.77 (1H, s, H-7), 7.78 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2,6), 6.92 (2H, d, J=8.6 Hz, H-3,5);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 193.0 (C-7), 165.4 (C-4), 133.6 (C-2,6), 130.5 (C-1), 117.0 (C-3,5)。上述光谱数据与文献[7]报道的基本一致，故确定该化合物为对羟基苯甲醛。

丁香醛 (Syringaldehyde, 3) 白色粉末，分子 式 为C9H10O4; ESI-MS m/z：205 [M+Na]+, 221 [M+K]+, 181 [M-H]-;1H NMR (500 MHz, CDCl3)：δ 9.80 (1H, s, CHO), 7.14 (2H, s, H-2, 6), 3.96 (6H, s, OCH3), 3.47 (1H, s, OH);13C NMR (125 MHz, CDCl3)：δ 190.9 (CHO), 147.6 (C-3, 5), 141.1 (C-4), 128.7 (C-1), 106.9 (C-2, 6), 56.7 (OCH3)。上述光谱数据与文献[8]报道的基本一致，故确定该化合物为丁香醛。

α-萘酚 (α-Naphthalenol, 4) 白色粉末, 分子式 为C10H8O; ESI-MS m/z：143 [M-H]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 7.98 (1H, m, H-8), 7.90 (1H, m, H-5), 7.75 (1H, d, J=8.3 Hz, H-4), 7.54-7.49 (2H, m, H-6, 7), 7.47 (1H, m, H-3), 7.25 (1H, dd, J=7.5, 0.9 Hz, H-2);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 148.4 (C-1), 136.3 (C-10), 129.2 (C-9), 129.1 (C-3), 127.6 (C-7), 127.5 (C-6), 126.7 (C-4), 126.7 (C-5), 122.4 (C-8), 119.6 (C-2)。上述光谱数据与文献[9]报道的基本一致，故确定该化合物为α-萘酚。

香草酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 (Vanillic acid-4-O-β-D-glucopyranoside, 5) 白 色 粉 末， 分子 式 为C14H18O9; ESI-MS m/z：353 [M+Na]+, 329 [M-H]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 7.63 (2H, m, H-2, 6), 7.19 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5), 5.00 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1’), 3.90 (3H, s, 3-OMe), 3.87 (1H, dd, J=12.1, 1.9 Hz, H-6’a), 3.70 (1H, dd, J=12.1, 5.4 Hz, H-6’b), 3.55-3.38 (4H, m, H-2’, 3’, 4’, 5’);13C NMR (125 MHz, CD3OD)： δ 167.9 (C-7), 151.6 (C-4), 150.3 (C-3), 127.8 (C-1), 124.6 (C-6), 116.6 (C-5), 114.7 (C-2), 102.2 (C-1’), 78.4 (C-5’), 78.0 (C-3’), 74.9 (C-2’), 71.4 (C-4’), 62.6 (C-6’), 56.8 (3-OMe)。上述光谱数据与文献[10]报道的基本一致，故确定该化合物为香草酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

5- 羟甲基糠醛 (5-Hydroxymethyl furfural, 6) 棕色油状，分子式为C6H6O3; ESI-MS m/z：149 [M+Na]+;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 9.56 (1H, s, H-6), 7.40 (1H, d, J=3.5 Hz, H-3), 6.61 (1H, d, J=3.5 Hz, H-4), 4.61 (2H, s, H-7);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 179.6 (C-6), 163.4 (C-2), 154.0 (C-5), 125.0 (C-3), 111.0 (C-4), 57.8 (C-7)。上述光谱数据与文献[11]报道的基本一致，故确定该化合物为5-羟甲基糠醛。

(3S,5R,6R,7E,9S)-3,5,6,9-Tetrahydroxy-7-megastigmene (7) 白色粉末，分子式为C13H24O4; ESIMS m/z：267 [M+Na]+, 283 [M+K]+, 279 [M+Cl]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 6.07 (1H, dd, J=15.9, 1.0 Hz, H-7 ), 5.79 (1H, dd, J=15.9, 6.3 Hz, H-8), 4.34 (1H, qd, J=6.4, 1.0 Hz, H-9), 4.05 (1H, m, H-3), 1.77 (2H, m, H-4), 1.65 (1H, t, J=12.0 Hz, H-2a), 1.45 (1H, ddd, J=1.6, 4.0, 12.0 Hz, H-2b), 1.27 (3H, d, J=6.4 Hz, H-10), 1.22 (3H, s, H-11), 1.10 (3H, s, H-13), 0.87 (3H, s, H-12);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 136.2 (C-8), 131.2 (C-7), 79.1 (C-6), 77.9 (C-5), 69.7 (C-9), 65.4 (C-3), 46.6 (C-2), 45.8 (C-4), 40.9 (C-1), 27.2 (C-11), 27.2 (C-13), 26.3 (C-12), 24.3 (C-10)。上述光谱数据与文献[12]报道的基本一致，故确定该化合物为 (3S,5R,6R,7E,9S )- 3,5,6,9-Tetrahydroxy-7-megastigmene。

(6R,9S)-9-Hydroxy-megastigma-4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside (8) 白色粉末，分子式为C19H30O7; ESI-MS m/z：393 [M+Na]+, 405 [M+Cl]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 5.92 (1H, s, H-4), 5.78 (1H, dd, J=15.3, 9.4 Hz, H-7), 5.62 (1H, dd, J=15.3, 7.5 Hz, H-8), 4.51 (1H, m, H-9), 4.32 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1’), 3..88 (1H, dd, J=11.9, 2.1 Hz, H-6’a), 3.66 (1H, dd, J=15.9, 6.2 Hz, H-6’b), 2.72 (1H, d, J=9.4 Hz, H-6), 2.50 (1H, d, J=16.8, H-2), 2.08 (1H, d, J=16.8, H-2), 3.32-3.15 (4H, m, H-2’, 3’, 4’, 5’), 2.01 (3H, s, H-13), 1.32 (3H, d, J=6.5, H-10), 1.06 ( 3H, s, H-12), 1.02 (3H, s, H-11);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 202.2 (C-3), 165.8 (C-5), 137.0 (C-8), 131.7 (C-7), 126.3 (C-4), 101.4 (C-1’), 78.5 (C-3’), 78.3 (C-5’), 74.9 (C-9, 2’), 71.9 (C-4’), 63.0 (C-6’), 57.0 (C-6), 37.3 (C-1), 28.2 (C-12), 27.5 (C-11), 24.0 (C-13), 22.4 (C-10)。上述光谱数据与文献[13]报道基本一致，故该化合物为(6R,9S)-9-Hydroxy-megastigma-4,7-dien-3-one-9-Oβ-D-glucopyranoside。

(3R, 9R)-9-O-β-D-Glucopyranosyl-3-hydroxy-7,8-didehydro-β-ionol (9) 白 色 粉 末， 分子 式 为C19H30O7; ESI-MS m/z：393 [M+Na]+, 405 [M+Cl]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 1.99 (1H, dd, J=17.5, 9.6 Hz, H-2a), 2.35 (1H, dd, J=17.5, 4.0 Hz, H-2b), 3.87 (1H, m, H-3), 1.99 (1H, dd, J=9.6, 17.5 Hz, 4-Ha), 2.35 (1H, dd, J=4.0, 17.5 Hz, 4-Hb), 4.96 (1H，q，J=6. 6 Hz，9-H), 1.49 (3H, d, J=6.6 Hz, H-10), 1.8 (3H, s, H-11), 1.11 (3H, s, H-12), 1.88 (3H, s, H-13), 4.68 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1’), 3.36 (1H, t, J=8.8 Hz, H-2’), 3.30-3.22 (3H, m, H-3’, 4’, 5’), 3.87 (1H, dd, J=11.9, 2.3 Hz, H-6’a), 3.67 (1H, dd, J=11.9, 5.6 Hz, H-6’b);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 37.5 (C-1), 47.6 (C-2), 62.9 (C-3), 42.1 (C-4), 139.5 (C-5), 124.6 (C-6), 85.0 (C-7), 93.8 (C-8), 65.3 (C-9), 22.8 (C-10), 29.1 (C-11), 31.2 (C-12), 22.8 (C-13), 101.3 (C-1’), 75.1 (C-2’), 78.3 (C-3’), 71.8 (C-4’), 78.3 (C-5’), 64.6 (C-6’)。上述光谱数据与文献[14]报道的基本一致，故确定(3R,9R)-9-O-β-D-Glucopyranosyl-3-hydroxy- 7,8-didehydro-β-ionol。

Cyclomargenol (10) 无定型淡黄色固体，分子 式 为C32H54O; ESI-MS m/z：477 [M+Na]+, 489 [M+Cl]-;13C NMR (125 MHz, CDCl3)：δ 32.2 (C-1), 30.0 (C-2), 79.1 (C-3), 40.7 (C-4), 47.3 (C-5), 21.3 (C-6), 27.2 (C-7), 48.2 (C-8), 20.2 (C-9), 26.3 (C-10), 26.2 (C-11), 33.1 (C-12), 49.0 (C-13), 45.5 (C-14), 35.8 (C-15), 28.3 (C-16), 52.4 (C-17), 18.3 (C-18), 30.2 (C-19), 36.6 (C-20), 18.7 (C-21), 34.3 (C-22), 30.6 (C-23), 50.0 (C-24), 148.2 (C-25), 18.2 (C-26), 111.3 (C-27), 25.7 (C-28), 14.2 (C-29), 19.5 (C-30), 26.2 (C-31), 12.2 (C-32)。上述碳谱数据与文献[15]报道的基本一致，故确定该化合物为Cyclomargenol。

N-p-香豆酰酪胺 (N-p-Coumaroyltyramine, 11) 白色粉末，分子式为C17H17NO3; ESI-MS m/z：283;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 7.58 (1H, d, J=15.8 Hz, H-8’), 7.45 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2’, 6’), 7.17 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3, 5), 6.81 (2H, d, J=8.6 Hz, H-3’, 5’), 6.74 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2, 6), 6.29 (1H, d, J=15.8 Hz, H-7’), 3.46 (2H, t, J=7.5, H-8), 2.80 (2H, t, J=7.5 Hz, H-7);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 169.2 (C-9’), 161.2 (C-4’), 157.5 (C-4), 146.5 (C-8’), 131.7 (C-1’), 131.2 (C-3’, 5’), 130.0 (C-3, 5), 127.5 (C-1), 116.9 (C-7’), 116.2 (C-2’, 6’), 115.9 (C-2, 6), 42.5 (C-8), 33.2 (C-7)。上述光谱数据与文献[16]报道的基本一致，故确定该化合物为N-p-香豆酰酪胺。

肌苷 (Inosine, 12) 白色粉末，分子式为C10H-12N4O5; ESI-MS m/z：291 [M+Na]+, 269 [M+H]+, 303 [M+Cl]-, 267 [M-H]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)：δ 8.32 (1H, s, H-8), 8.20 (1H, s, H-2), 5.99 (1H, d, J=6.3 Hz, H-1’), 4.74 (1H, dd, J=6.3, 5.3 Hz, H-3’), 4.34 (1H, dd, J=5.3, 2.6 Hz, H-2’), 4.18 (1H, q, J=2.6 Hz, H-4’), 3.89 (1H, dd, J=12.5, 2.6 Hz, H-5a’), 3.76 (1H, dd, J=12.5, 2.6 Hz, H-5b’);13C NMR (125 MHz, CD3OD)：δ 157.2 (C-6), 152.8 (C-2), 150.1 (C-4), 142.4 (C-8), 121.1 (C-5), 91.3 (C-1’), 88.3 (C-4’), 75.7 (C-3’), 72.7 (C-2’), 63.5 (C-5’)。上述光谱数据与文献[17]报道的基本一致，故确定该化合物为肌苷。

2 结果与讨论

本研究利用色谱柱层析分离手段，从铁皮石斛叶乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中共分离得到12 个化合物，通过光谱数据分析及与文献数据对照，鉴定它们的结构包括5 个酚酸类化合物即4-羟基苯乙酮 (1)、对羟基苯甲 醛 (2)、丁 香 醛(3)、α- 萘 酚(4)、香 草 酸-4-O-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 苷 (5)，3 个 萜 烯 类 化 合 物即(3S,5R,6R,7E,9S)-3,5,6,9-tetrahydroxy-7-megastigmene (7)、(6R,9S)-9-hydroxy-megastigma-4,7-dien-3-one-9-O-β-D-glucopyranoside(8)、(3R,9R)-9-O-β-D-glucopyranosyl-3-hydroxy-7,8-didehydro-β-ionol (9)，1 个甾体化合物cyclomargenol (10)，一个苯丙素类化合物N-p-香豆酰酪胺 (11)，以及2 个其他类即5-羟甲基糠醛 (6)和肌苷 (inosine，12)。其中cyclomargenol (10)为首个自铁皮石斛中分离得到的甾体类成分，文献报道其具有很强的体外抗炎活性，能抑制非甾体类消炎药靶标酶环氧合酶的活性，在10 μm 浓度下显示出比吲哚美辛更强的抑制活性[15]。化合物4、5、7、8、9、10 为首次从石斛属中分离获得。

石斛药用历史悠久，早在秦汉时期的《神农本草经》就有“主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴，久服厚肠胃”的记载。铁皮石斛是石斛属植物中的珍贵品种，现代临床和药理研究也证明，铁皮石斛具有增强免疫、抗衰老、抗肿瘤和降血糖等药理作用[18-19]。本研究以铁皮石斛叶为原料，对其化学成分展开了系统研究，对于推进解析铁皮石斛叶的化学物质基础和促进其开发利用具有积极意义。