水凝胶涂覆纸喷雾离子化用于生物流体样品直接质谱分析

何元毅，詹柳娟，黄光明

(中国科学技术大学 化学与材料科学学院，安徽 合肥 230026)

纸喷雾离子源(Paper spray ionization,PSI)[1]作为敞开式大气压离子源(Ambient ionization)技术之一，已被广泛应用于检测生物流体中的药物及其代谢物[2-3]、蛋白质[4]、食品与环境中的污染物[5]和细菌中脂质[6-7]等。PSI具有集采样、样品分离和离子化于一体的独特优势，大大地简化了质谱分析步骤，提高了样品分析速度；纸基质具有色谱层析作用，可有效地减少离子抑制和基质效应；纸具有多孔性结构，不会造成堵塞，可直接分析液态和固态复杂样品；纸基质环境友好，生物相容性好，便于生物样品的储存运输；装置简单，便于和微型质谱仪联用。然而，在分析复杂生物样品时，由于基质效应的影响，纸喷雾质谱的检测性能仍然会大打折扣[8]。

近年来，许多研究工作致力于在纸喷雾质谱中联用如免疫分析[9-11]、固相萃取/固相微萃取(SPE/SPME)[12-13]和液液萃取[14]等净化富集技术以提升方法性能。PSI-MS与免疫技术联用，利用免疫反应的特异性结合，可实现高选择性富集被分析物，具有其他方法难以替代的优势。PSI-MS与固相萃取/固相微萃取技术联用，可将被分析物富集在固定相上，提升选择性和灵敏度，无需制备反应，重现性较好。PSI-MS与液液萃取技术联用，可将萃取溶剂作为喷雾溶剂，实现微量样品的在线萃取、分析，降低样品基质复杂性，提高分析精确度和灵敏度。其对样品量要求小，使用一次性材料，无需清洗步骤，具有较好的实用性。Damon等[14]在疏水化处理的纸基质上，实现了4 μL生物样品的在线液液萃取和定量分析。PSI-MS与液液萃取联用，使用疏水化处理[15-18]的纸，样品扩散作用弱，易实现液液萃取；使用乙酸乙酯作为喷雾溶剂，其与生物样品互不相溶，对于弱极性物质具有较好的萃取和离子化效果[19]。然而，乙酸乙酯在纸基质上扩散严重，导致蒸发速度过快，萃取效率低且喷雾时间短，降低了信号强度[20-21]。因此，PSI-MS与液液萃取的联用需发展一种喷雾时间长，且能提高被分析物的质谱信号强度的方法。

本研究提出一种水凝胶涂覆纸喷雾离子化的方法。琼脂糖在纸表面发生物理交联，形成具有三维网络结构的水凝胶[22]。水凝胶具有限制溶液扩散的作用[23]，在水凝胶涂覆的纸基质上滴加的溶液，可在一定时间内保持液滴状态，减少挥发面积。在琼脂糖涂覆的纸基质表面滴加互不相溶的生物流体样品液滴和喷雾溶剂液滴，即可实现更有效的液液萃取，延长信号持续时间的同时，提高质谱检测灵敏度。本方法材料制作简单，分析方法快速，且无需前处理，可直接快速完成微量生物流体样品中治疗药物的定量分析。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

卡马西平、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、阿替洛尔、兔全血、琼脂糖购自Sangon Biotech公司；普萘洛尔、卡马西平10，11-环氧化合物购自阿拉丁公司；阿米替林、阿米替林-D6、甲醇(纯度≥99.9%)购于百灵威公司；乙酸乙酯(纯度≥99.5%)购自国药集团；人尿样来自实验室志愿者；实验用水为去离子水(美国Millipore超纯水仪制备)；色谱纸为Whatman 1 CHR(200 mm×200 mm)。其中，阿米替林-D6、普萘洛尔、卡马西平10，11-环氧化合物、磺胺甲基嘧啶分别为阿米替林、阿替洛尔、卡马西平和磺胺二甲基嘧啶的内标物。

1.2 纸基质制备

水凝胶涂覆纸基质制备：将色谱纸浸入60 ℃ 2%琼脂糖水溶液中，使两面覆盖均匀，将纸悬挂在通风橱晾至表面干燥，剪成高10 mm，宽8 mm的等腰三角形，折叠成如图1A所示形状，备用。

常规纸喷雾纸基质制备：将未经修饰的色谱纸剪成高10 mm，宽8 mm的等腰三角形，备用。

1.3 纸喷雾分析

水凝胶涂覆纸喷雾装置如图1B所示，将制备好的水凝胶涂覆纸基质置于质谱口约5 mm处，滴加4 μL样品和8 μL乙酸乙酯呈液液萃取状态，在纸基质表面施加3 kV直流高压，形成喷雾，产生的喷雾液滴最终进入质谱。常规纸喷雾质谱使用色谱纸，其他参数同水凝胶涂覆的纸喷雾质谱。定量分析时纸喷雾质谱方法使用4 μL样品和15 μL甲醇。

阿米替林的质谱定量分析使用LTQ Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientic,San Jose,CA,USA)进行测定,其余纸喷雾质谱实验均使用LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪(Thermo Fisher Scientic)进行测量。所有谱图均为正离子模式，质谱仪毛细管入口温度设置为275 ℃，纸喷雾所加高压设定为3 kV。通过碰撞诱导解离(CID)能量获得的串联质谱(MS/MS)谱图用于分析，碰撞诱导解离的能量设置为35%，m/z隔离宽度为2.0。卡马西平m/z237.2→194.1，卡马西平10，11-环氧化合物m/z253.0→236.1，阿替洛尔m/z267.2→190.1，普萘洛尔m/z260.2→183.1，磺胺二甲基嘧啶m/z279.2→186.0，磺胺甲基嘧啶m/z265.2→172.1，阿米替林m/z278.1→233.2，阿米替林-D6m/z286.1→233.2。离子注入时间设定为10 ms，所得信号为3次扫描的平均信号。

图1 水凝胶涂覆纸喷雾装置图、简图及喷雾图

2 结果与讨论

2.1 水凝胶涂覆纸喷雾过程

样品和乙酸乙酯在水凝胶涂覆的纸基质上被固定在纸张的前半部分区域，难以向后扩散，形成液液萃取，最终润湿纸张(图1B)。水凝胶涂覆纸喷雾萃取待测物及待测物离子化过程如图1C所示。由于水凝胶网络内部富含水分子，导电性能好，没有全部润湿的纸张仍可导电，并形成稳定的喷雾。喷雾过程如图1所示，先滴加样品和乙酸乙酯形成液液萃取(图1D)，接通电压即形成喷雾(图1E)，短暂时间后持续形成稳定喷雾(图1F)，直至乙酸乙酯全部消耗(图1G)。

2.2 分析尿样中药物提升信号强度并延长喷雾时间

本方法采用水凝胶涂覆纸基质，使乙酸乙酯维持液滴形式，减少其挥发面积，以减慢挥发速度，延长萃取和喷雾时间。生物流体样品在水凝胶涂覆纸基质的表面也呈现为液滴形态，与乙酸乙酯仅在表面相接触，从而实现高效的液液萃取(图1C)。因此，水凝胶涂覆纸喷雾能延长喷雾时间，提升质谱信号。为评估该方法，对比了人尿液中卡马西平的常规纸喷雾和水凝胶涂覆纸喷雾检测。将含有500 ng/mL卡马西平的尿液在2种离子源中分别进样分析，比较MS/MS特征离子峰信号强度和喷雾时间差异(图2)。结果显示，与常规纸喷雾相比，水凝胶涂覆纸喷雾信号提升100倍，喷雾时间延长近10倍。使用8 μL乙酸乙酯时，与常规纸喷雾质谱喷雾时间仅为0.12 min相比，水凝胶涂覆纸喷雾质谱喷雾时间可达0.94 min。

2.3 实验条件优化

为获得水凝胶纸喷雾的最佳操作参数，实验以人尿液中的卡马西平(500 ng/mL，4 μL)为样品，对电压、喷雾溶剂用量和种类等参数进行了优化。

电压对纸喷雾质谱的信号强度有较大影响，若电压过低，不能形成喷雾或喷雾不稳定，质谱信号低；电压过高，喷雾会形成cone-jet模式[24]，且易发生放电现象，稳定信号时间短。考察了不同电压(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 kV)对卡马西平离子强度的影响。结果显示，施加2.5 kV电压时喷雾太小，分析物信号几乎观察不到；施加3.0～3.5 kV电压时信号较好；施加4.0 kV以上电压时，会形成cone-jet模式，卡马西平的信号降低。因此，将水凝胶涂覆纸喷雾质谱施加电压设定在3.0～3.5 kV。

喷雾溶剂用量也会对质谱信号强度产生较大影响。相对于样品量，若喷雾溶剂用量太多会有显著的稀释效应，待测物在萃取溶剂中的最终浓度将会严重降低，从而降低信号强度；喷雾溶剂量过少会导致过快挥发，影响萃取时间，且挥发过快也会导致喷雾信号的不连续。实验考察了分析4 μL样品时，乙酸乙酯用量(4、8、12、16 μL)对卡马西平离子信号和喷雾时间的影响。结果显示，使用8 μL乙酸乙酯时，分析物信号最强；而乙酸乙酯用量大于8 μL时，喷雾持续时间相对较长。因此喷雾溶剂最佳用量选择8 μL。

此外，还研究了萃取和喷雾溶剂的种类对质谱信号的影响。选取的溶剂同时作为萃取溶剂和喷雾溶剂，需综合考虑待测物在其中的溶解度和离子化效率、溶剂挥发性等因素。通过实验发现与样品液滴和水凝胶均不互溶的多种溶剂能观察到喷雾现象，质谱信号由强到弱依次为乙酸乙酯、叔丁基甲醚、正丁醇、丙酮、氯仿、正己烷和甲苯，因此选择乙酸乙酯为最佳的萃取和喷雾溶剂。

2.4 定量分析

在最佳条件下，采用本方法对人尿液中阿米替林(AMT)进行定量分析。AMT以5、50、200、500、1 000 ng/mL的质量浓度加入尿液，阿米替林-D6(D6-AMT)以100 ng/mL的质量浓度作为同位素标记的内标物加入。将4 μL配制好的尿液滴加在水凝胶涂覆纸基质上，再滴加8 μL乙酸乙酯形成液液萃取，施加3 kV高压进行检测，每个浓度重复测定3次。以相对强度(AMT/D6-AMT，y)与对应人尿液中阿米替林质量浓度(x,ng/mL)绘制标准曲线，得其线性方程为y=0.006 7x+0.148 6，r2=0.999 4。以加入内标的空白样品的3倍标准偏差(n=3)除以标准曲线的斜率计算得AMT的检出限(LOD)为0.21 ng/mL。分别采用本方法和纸喷雾质谱方法对含有阿替洛尔、卡马西平或磺胺二甲基嘧啶的兔全血进行定量分析，计算得到各化合物的LOD，结果见表1，本方法定量分析检测灵敏度提升了7～33倍。

表1 使用水凝胶涂覆纸喷雾质谱分析4种药物的检出限及与纸喷雾质谱的对比

2.5 水凝胶涂覆纸喷雾质谱对生物流体中药物的直接分析

水凝胶涂覆纸喷雾质谱可实现对复杂生物流体中药物的直接分析。未进行任何前处理，使用水凝胶涂覆纸喷雾质谱在兔全血和人尿样中直接检测卡马西平的结果，及其与纸喷雾质谱检测结果的对比见图2。全质谱图中m/z237为卡马西平的质子加合峰，MS/MS谱图中m/z194为卡马西平的特征子离子峰。

图2 水凝胶涂覆和常规纸喷雾质谱在生物流体中直接分析卡马西平的谱图

3 结 论

本研究利用水凝胶限制溶液扩散的性质，开发了一种水凝胶涂覆纸喷雾离子化技术，可以有效结合液液萃取技术，实现生物流体样品的高灵敏定量分析。本方法制备快速、简单可靠，能直接分析生物流体中的药物，且能延长稳定喷雾时间，提升质谱信号强度。通过加入内标，实现了对全血和尿液中药物的直接定量分析，检出限比常规纸喷雾离子化降低7～33倍，在临床实时检测中具有较大潜力。