老年宫颈癌患者血清一氧化氮、半乳凝素-9表达及其与细胞凋亡的相关性

张冬丽 李艳云 孙桂霞 张红霞

(河南大学淮河医院妇产科，河南 开封 475000)

宫颈癌也称为宫颈浸润癌，是女性常见的一种恶性肿瘤，根据近年来流行学调查研究显示，宫颈癌发病率近年来呈逐年上升趋势〔1〕。一氧化氮(NO)是生物体内普遍存在的一种活泼的小分子物质，可参与信息传递、机体免疫应答、血管舒张调节、细胞凋亡等正常生理活动〔2，3〕。NO与多种病理过程相关，尤其与肿瘤血管生成及肿瘤细胞凋亡等有关〔4〕。半乳凝素(Gal)家族在动植物组织中有广泛分布，可参与机体免疫调节、细胞增殖凋亡、细胞黏附及RNA转录加工等多种病理生理过程〔5〕。其中Gal-9在机体炎症反应、肿瘤转移、细胞生长分化等方面具有突出的影响〔6〕。本研究旨在探讨老年宫颈癌患者血清NO、Gal-9表达及其与细胞凋亡的相关性。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2015年3月至2017年6月河南大学淮河医院收治的76例老年宫颈癌患者，均经术后病理结果确诊，年龄≥60岁；排除非宫颈原发肿瘤患者、合并其他恶性肿瘤患者。宫颈癌患者年龄60～82岁，平均(69.83±6.12)岁；低分化18例(23.68%)、中分化41例(53.95%)、高分化17例(22.37%)；按照国际妇产科联盟(FIGO)病理分期标准：Ⅰ期16例(21.05%)、Ⅱ期25例(32.89%)、Ⅲ期27例(35.53%)、Ⅳ期8例(10.53%)；组织病理学分型：鳞癌58例(76.32%)、腺癌18例(23.68%)；淋巴结转移34例(44.74%)、未转移42例(55.26%)。

再选择同期收治的老年子宫颈上皮不典型增生(CIN)患者50例及老年健康人群50例作为对照。CIN组中年龄60～80岁，平均(68.79±6.38)岁，其中CIN Ⅱ期28例(56.00%)、CIN Ⅲ期22例(44.00%)。健康对照组年龄60～83岁，平均(69.57±7.21)岁。三组受试者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2流式细胞技术测定细胞凋亡指数(AI) 分别取宫颈癌组织、CIN组织及正常宫颈组织，置于盛有磷酸盐缓冲液(PBS)的小烧杯内，使用眼科剪将其反复剪碎后过滤(160目尼龙网筛)，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×109/L。取1 ml单细胞悬液，离心后弃去上清，加入1 ml PBS，重复离心后弃去上清。使用预冷的70%乙醇固定细胞，然后置于4℃冰箱内过夜。次日离心5 min，弃去上清后使用PBS漂洗一次，加入Pnase合成期(PNase)酶37℃作用半小时，加入50 μg/ml碘化丙啶(PI)1 ml，4℃避光染色20 min，过滤，使用羧基麦芽糖铁(FCM)测定。以正常人外周血淋巴细胞作为正常二倍体标准，使用CELLQUEST分析软件计算各组细胞AI。

1.3血清NO、Gal-9水平检测 采集三组受试者清晨空腹静脉血5 ml，肝素抗凝，离心分离血清，-40℃保存待测。采用硝酸还原酶法检测受试者血清NO水平，NO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；采用双单抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测受试者血清Gal-9水平，Gal-9 ELISA检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。操作严格按照试剂盒使用说明书进行。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、方差分析、χ2检验、秩和检验和Spearman相关分析。

2 结 果

2.1三组细胞凋亡指数比较 三组受试者AI比较差异具有统计学意义(F=28.719，P<0.05)，其中宫颈癌组AI指数(6.31±5.60)显著高于健康对照组(2.38±0.73，P<0.05)，但明显低于CIN组(9.33±2.46，P<0.05)。

2.2三组血清NO、Gal-9表达比较 三组血清NO、Gal-9水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)，且宫颈癌组血清NO、Gal-9水平显著高于健康对照组与CIN组(P<0.05)，见表1。

表1 三组血清NO、Gal-9水平比较

与健康对照组比较：1)P<0.05；与CIN组比较：2)P<0.05

2.3宫颈癌患者血清NO、Gal-9水平与细胞凋亡相关性分析 宫颈癌患者血清NO、Gal-9水平与AI呈显著正相关(r=0.813、0.872，P<0.05)。

2.4血清NO、Gal-9水平与老年宫颈癌患者临床病理特征关系 宫颈癌临床分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清NO、Gal-9水平显著高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P<0.05)，肿瘤低分化患者血清Gal-9水平显著高于中、高分化患者(P<0.05)，其余临床病理特征对血清NO、Gal-9水平无明显影响(P>0.05)，见表2。

表2 血清NO、Gal-9水平与老年宫颈癌患者临床病理特征关系

3 讨 论

细胞凋亡是一种与有丝分裂相反的方式调节细胞群体相对稳定的重要方式，在细胞发育、增殖、分化及死亡过程中均有重要的影响，同时，细胞凋亡对于肿瘤的发生、抗肿瘤药物的治疗及细胞间信息传递等方面同样有着重要的作用〔7～9〕。本研究表明当宫颈上皮细胞发生不典型增生时，细胞凋亡增加，此时仍能维持细胞增殖与死亡之间的平衡；而宫颈癌患者细胞凋亡较CIN患者明显降低，表明随着病变加重至癌变阶段，细胞凋亡率减少，提示宫颈癌的发生发展与细胞凋亡之间有着密切的相关性，随着疾病的进展及细胞内相关基因表达的变化，细胞凋亡受到抑制，导致宫颈上皮细胞平衡被破坏，从而引发癌变〔10，11〕。

NO是一种非常活泼的自由基，可对机体血管、神经系统等发挥重要的调节作用，但NO浓度较高时具有一定的细胞毒性，在肿瘤的发生发展中发挥一定的作用〔12〕。近年来学者报道显示，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在子宫颈癌、卵巢癌等多种妇科肿瘤组织中均有明显表达上调趋势，提示肿瘤组织局部NO生成增多〔13,14〕。Gal-9在细胞质、细胞外基质及细胞核内均有分布，研究表明，Gal-9在胃肠道、肝脏及各种免疫细胞中均有高表达，同时在胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等不同肿瘤组织中也检测到了Gal-9表达〔15,16〕。本研究结果提示宫颈上皮细胞不典型增生至癌变过程中，NO及Gal-9发挥着一定的作用，与相关研究报道结果相似〔17〕。

关于NO对细胞凋亡的影响，研究显示，NO可诱导肌母细胞、视网膜神经细胞及巨噬细胞发生凋亡，但是其对肝细胞、B淋巴细胞凋亡起着抑制作用〔18〕。而报道显示，Gal-9可诱导胸腺细胞、T细胞及巨噬细胞的凋亡，同时对肿瘤细胞凋亡、转移等发挥了一定作用〔19，20〕。本研究结果提示NO、Gal-9参与到了宫颈癌细胞凋亡过程中，且随着患者肿瘤临床分期的增加，NO、Gal-9水平显著升高，表明在机体对抗肿瘤发生发展过程中，可能受到NO、Gal-9等多种因素的影响，导致细胞凋亡与增殖的平衡被打破。

综上，血清NO、Gal-9参与到了老年宫颈癌发生发展过程中，同时对宫颈癌组织细胞凋亡发挥一定的影响作用，其具体影响机制，还需深入研究。