羊肚菌抗氧化肽的制备、纯化和鉴定

范三红，田 雨，张锦华

（山西大学生命科学学院，特色植物资源研究与利用山西重点实验室，山西太原030006）

羊肚菌作为一种珍稀食药兼用菌，以其特有的香味和较高的营养价值而受到世界各地的关注，被评为最珍贵的食用菌之一[1]。羊肚菌具有作为天然药物的巨大潜力，自发现以来，已经在传统医学中使用了几个世纪，其营养特性在国际上备受推崇，其蛋白质含量在20%以上，是一种重要的营养资源[2]。目前，研究表明，羊肚菌具有抗氧化[3]、降血脂、抑肿瘤、抗疲劳等保健功能[4-8]。

多肽是蛋白质水解的中间产物，从生物体内提取的多肽大多具有较强的活性，特别是其较高的抗氧化性质[9-11]。抗氧化肽可以通过抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的方式保护人体组织器官，其抗氧化能力是根据分子供氢的能力和自身结构的稳定性共同决定的[12]。食物蛋白通过水解作用得到的抗氧化肽具有安全性高、抗氧化性强和易被吸收等特点，故成为当今世界研究的热点[13-14]。

复合酶解工艺具有提取快、条件温和、有效增加提取物质活性等特点，目前已经被证实，其在大豆蛋白[15]、紫菜藻红蛋白[16]等提取中具有较好的效果。超声波可以产生高速、强烈的空化效应以及搅拌作用，将这种作用应用到辅助酶解过程中，能够有效地加快酶解进程，加大产物得率[17-18]。周艳华等[19]通过使用复合酶法使可溶性蛋膜蛋白酶解产物的水解度提高到46.12%。张辉等[20]利用超声辅助酶解的方法制备了抗氧化性能较高的麦麸多肽，其OH自由基清除率达到83.13%，DPPH自由基清除率为78.86%。

目前，以食物中蛋白酶解生成的小分子多肽为原料，进行产品开发的思路已经被国际社会广泛关注，而如何能够高效提取具有极强生物活性的多肽，也成为研究热点。

本研究以羊肚菌蛋白为原料，初步研究优化超声辅助复合酶法制备抗氧化多肽的工艺，并对抗氧化肽的活性及氨基酸序列进行分析，旨在为羊肚菌蛋白的进一步开发提供思路和支持。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

羊肚菌子实体购于山西省安泽县惠原科贸有限公司，品种为褐赭羊肚菌（Morchella umbrina）。

中性蛋白酶（6.0×104U/g）、胰蛋白酶（2.5×105U/g）、碱性蛋白酶（2.0×105U/g）、木瓜蛋白酶（6.0×106U/g）、风味蛋白酶（6.0×104U/g）、复合蛋白酶（1.0×105U/g）、菠萝蛋白酶（5.0×105U/g）均购于北京索莱宝科技有限公司；DEAE-32、G-25、DPPH均购于美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

SP-2000UV型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；BS-100A自动部分收集器、HD-21-1核酸蛋白检测仪、TH-1000梯度混合器、BT-100数显蠕动泵，上海青浦沪西仪器厂；SB25-12DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司；QExactive mass spectrometer，Thermof isher。

1.2 试验方法

1.2.1 羊肚菌多肽的制备工艺 粉碎适量的羊肚菌子实体（过0.177 mm筛），以料液比1∶30配成混合液（羊肚菌粉∶水），调节pH值为11，超声功率辅助条件为200 W/30 min，在4 000 r/min下离心25 min，取上清液；用1 mol/L的HCl溶液调节pH值为4.5，在4 000 r/min下离心25 min，得沉淀；将沉淀反复水洗后离心分离；最后将得到的蛋白进行冷冻干燥，得到羊肚菌蛋白粉末。将羊肚菌蛋白粉复溶配成5%的蛋白溶液，调节蛋白溶液温度和pH，超声辅助下进行酶解，反应结束后置于95℃灭酶10 min，4 000 r/min离心15 min，取上清液，调节pH值至中性后冷冻干燥，即得羊肚菌多肽。

1.2.2 复合酶的筛选

1.2.2.1 单酶酶解试验 配制质量浓度为5%的羊肚菌蛋白溶液，取相同体积（50 mL）溶液分别加入碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及菠萝蛋白酶，总加酶量固定为4000U/g，保持各类酶在其最适温度和pH条件下对底物进行水解。

1.2.2.2 复合酶的选择 以DPPH自由基清除率及水解度为参考指标，依托单酶试验结果，选用3种蛋白酶进行复合酶解试验，酶配比固定为1∶1，继续优化酶解方案。

1.2.2.3 最佳酶配比确定 在总加酶量为4 000 U/g的条件下，探究复合酶不同酶活力配比对羊肚菌蛋白酶解产物的影响。

1.2.3 超声波辅助方法的探究 分别在不加超声波（空白）、高频（69.0 kHz）、中频（47.0 kHz）、低频（25.0 kHz）及不同功率（200、300、400 W）条件下进行酶解试验，从而探究超声波条件对酶解反应的影响作用。

1.2.4 羊肚菌蛋白酶解工艺优化单因素试验 基本的超声辅助酶解条件为：加酶量4 000 U/g，超声功率为300 W，温度50℃，pH值为8，时间50 min。在其他条件不变的基础上，以DPPH自由基清除率（%）为指标，分别选取加酶量 2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，酶解 pH 值 6、7、8、9、10，酶解时间30、40、50、60、70 min，酶解温度 40、45、50、55、60 ℃，进行单因素试验。

1.2.5 羊肚菌蛋白酶解工艺响应面实验 响应面实验设计水平编码列于表1。

表1 因素水平编码

1.2.6 羊肚菌抗氧化多肽产物的纯化

1.2.6.1 超滤法分离纯化 选用10 ku规格的超滤膜，在压力为3.0×104Pa下将羊肚菌多肽酶解液分离为2个组分，冷冻干燥备用。

1.2.6.2 DEAE-32分离纯化 选用20 mm×400 mm规格层析柱，用50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）的缓冲液平衡柱床，上样量3 mL，用0～1 mol/L NaCl平衡缓冲液进行梯度洗脱，流速为1.5 mL/min，紫外检测波长220 nm。

1.2.6.3 Sephadex G-25分离纯化 选用16 mm×300 mm规格层析柱，洗脱条件为：平衡缓冲溶液100 mmol/L、pH值 7.5 的 Tris-HCl，上样量 3 mL，洗脱流速0.5 mL/min，紫外检测波长220 nm。

1.2.7 多肽氨基酸序列鉴定 氨基酸序列采用LC-MS-MS质谱进行鉴定。参照薛海燕等[21]的方案进行实验参数的设定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 水解度的测定 参考相关文献，碱性和中性环境下采用pH-Stat法测定水解度；酸性条件下采用甲醛滴定法测定水解度[22]。

1.3.2 DPPH自由基清除率的测定 其参照任嘉兴等[23]的羊肚菌多糖抗氧化研究试验方案进行。

2 结果与分析

2.1 酶解方案的确定

各种类蛋白酶单酶酶解情况列于表2。

表2 各种类蛋白酶酶解情况

从表2可以看出，不同蛋白酶水解效果呈现多样性，其中酶解效果较好的3种酶分别为碱性蛋白酶、胰蛋白酶和复合蛋白酶，在最适条件下相应的水解度（分别为22.24%，19.73%和17.51%）和DPPH自由基清除率（分别为51.43%，47.29%和44.62%）都显著高于其余蛋白酶。故选用这3种酶进行复合酶的筛选试验，其中①为碱性蛋白酶，②为胰蛋白酶，③为复合蛋白酶（表3）。

表3 复合酶水解羊肚菌粗蛋白的不同酶解方案及结果

如表3所示，3种蛋白酶分别以1∶1的比例进行复合对羊肚菌粗蛋白进行酶解，复合酶的水解度和DPPH自由基清除率均显著高于单一酶的作用（表2），其中①＋②的试验效果最好。对这2种酶进行酶活力配比优化，结果如图1所示，当碱性蛋白酶∶胰蛋白酶为7∶3时，水解度和DPPH自由基清除率均最大，确定该配比为最佳复合酶配比。

2.2 超声波辅助酶解方案的确定

从图2可以看出，与对照组相比，超声波频率在200、300 W时清除率明显提高，且在频率为300 W时效果最显著，这可能是因为超声空化效应的增强，使得底物与酶的接触更加充分[24]；而当功率达到400 W时，DPPH自由基清除率明显降低，可能是因为功率太大，导致酶活性的降低和抗氧化多肽的失活。综合比较酶解反应在低、中、高频的表现，选取超声波低频（25.0 kHz）、功率300W为超声波辅助酶解条件。

2.3 羊肚菌酶解工艺优化单因素试验结果

从图3-a可以看出，酶解时间为30～50 min时，DPPH·清除率出现增值的趋势；当酶解时间达50 min时出现了峰值，可能是由于通过增加酶解时间，蛋白质的水解度提高，最终产生大量抗氧化活性的多肽，之后酶解反应继续进行，一些小分子的多肽水解为氨基酸，从而丧失了抗氧化活性。

从图3-b可以看出，在所设置温度范围内（40～60℃），DPPH·清除率出现先升高后下降的趋势，酶解温度55℃为最优条件，可能是由于较高的温度会降低复合酶的活性，从而使DPPH·清除率降低。

如图3-c所示，DPPH·清除率受pH影响较大，当pH值为8时，DPPH·清除率达到最高，而当pH值低于8时，随pH增大清除率呈现上升趋势，可能是由于较低的pH值对复合酶活力影响较大；当pH值大于9后，清除率出现了明显下降，可能是由于较高的pH值导致多肽结构被破坏，从而引发活性降低。

由图3-d可知，DPPH·清除率随加酶量增加呈现先升高后降低的趋势，当加酶量为3 000 U/g时DPPH·清除率达最大，之后呈现缓慢下降趋势，可能是由于过量的加酶量引发蛋白质和小分子多肽的过度水解，生成了不具备活性的氨基酸，从而使得整体清除率下降[25]。综合全部试验结果，确定最适酶解方案为：时间50 min、温度55℃、pH值8.0、加酶量3 000 U/g。

2.4 超声波辅助酶解工艺响应面分析

在单因素试验基础上，以酶解时间A（min）、酶解温度 B（℃）、酶解 pH 值 C、加酶量 D（U/g）为影响因素，以DPPH自由基清除率Y（%）为响应值，采用软件Design-Expert 8.0进行四因素三水平响应面实验设计与数据处理，其结果列于表4。

回归与方差分析结果如表5所示。建立二次响应面回归模型如下：Y＝88.38＋4.44A＋5.61B＋6.53C＋3.30D－2.19AB－5.24AC＋1.27AD＋2.34BC＋0.27BD－3.25CD－7.88A2－12.84B2－16.80C2－0.72D2。

从表5可以看出，该模型回归显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），并且该模型R2＝92.7%，说明该模型与试验拟合良好。其中，模型A、B、C为极显著影响因子，D为显著影响因子，说明影响因素对试验结果都具有较为明显的影响作用。两因素交互项AC影响显著，其响应面图如图4所示。

表4 试验方案及结果

表5 回归与方差分析结果

通过软件寻找最优超声辅助酶解工艺条件得到，当酶解时间为60 min、酶解温度为55.69℃、酶解pH值为7.95、加酶量为4 000 U/g时，得到的酶解多肽DPPH自由基清除率最大，为89.09%。在最优超声辅助条件下，修正温度为56℃，pH值为8，进行3次验证试验，取平均值，DPPH自由基清除率为89.97%，表明试验值与回归方程预测值吻合良好。

2.5 超滤法分离纯化羊肚菌多肽的结果

将小于10 ku和大于10 ku这2个组分冷冻干燥之后配制为0.3 mg/mL的溶液进行测定，结果如图5所示，测定结果显示，小于10 ku的羊肚菌多肽组分具有更好的DPPH自由基清除作用，清除率为86.43%，所以选择小于10 ku组分继续进行下一步分离纯化。

2.6 DEAE-32分离纯化羊肚菌多肽的结果

将超滤得到的小于10 ku的组分进一步经DEAE-32分离得到4个洗脱峰，分别命名为组分D1、D2、D3、D4，结果如图 6 所示。将各组分冷冻干燥之后配制为0.3 mg/mL的溶液进行测定，结果显示，D3组分的清除率最高，为94.57%，故将D3组分作为下一步分离纯化研究的对象。

2.7 Sephadex G-25分离纯化羊肚菌多肽结果

将D3组分继续经过Sephadex G-25分离后得到 3 个洗脱峰，分别命名为 G1、G2、G3（图 7）。将各组分冷冻干燥后配制为0.3 mg/mL的溶液进行测定，如图7所示，清除DDPH自由基的能力表现为G2＞G1＞G3，其中G2组分清除率达到96.71%，具有较高的抗氧化能力。

2.8 羊肚菌抗氧化多肽G2组分LC-MS-MS鉴定

如图8所示，根据LC-MS-MS鉴定，得到G2有效成分为单个寡肽，肽段质量为779.433，其氨基酸序列为 FPLIPGH，即苯丙氨酸（Phe）- 脯氨酸（Pro）-亮氨酸（Leu）-异亮氨酸（Ile）-脯氨酸（Pro）-甘氨酸（Gly）- 组氨酸（His）。

3 结论

本试验对超声辅助酶解制备羊肚菌抗氧化多肽工艺进行研究，探讨了复合酶配比、超声功率、加酶量、反应温度、反应时间、反应pH对羊肚菌抗氧化肽制备的影响。在单因素试验的基础上采用响应面分析法进行优化，最终确定了最优条件为：酶解时间60 min、酶解温度55.69℃、酶解pH值7.95，加酶量4 000 U/g。通过该方案制备的羊肚菌多肽DPPH自由基清除率达到89.09%。将所得多肽经过超滤、DEAE-32、Sephadex G-25 进行分离纯化，最终筛选到DPPH自由基清除率最高的多肽组分，其清除率达到96.71%。经LC-MS-MS鉴定，该组分多肽氨基酸序列为FPLIPGH，其具有很高的研究价值，可以为功能食品开发和化妆品开发领域提供数据参考和支持。