急性弛缓性麻痹监测系统实验室检测方法研究进展*

彭靖尧，赵 华，黄 为，谢武娟，凌 华，张 敏 综述，王 亚 审校

1.重庆市疾病预防控制中心,重庆 400042；2.重庆市江北区疾病预防控制中心，重庆 400020

急性弛缓性麻痹(AFP)是一大类复杂综合征的统一名称。广义的理解下，AFP是对所有能引起肌张力减弱、肌力下降、腱反射消失疾病的统称,按其病因又可以分为传染性病例和非传染性病例,并且绝大多数的病例是传染性的[1]。全球AFP研究领域中对AFP的定义是一种狭义的定义，就是世界卫生组织在倡导消灭脊髓灰质炎建立AFP监测系统中对AFP的定义[2]。尽管监测系统中的定义不能涵盖所有AFP，但它几乎包含了所有的传染性AFP病例，尤其是由脊髓灰质炎病毒(PV)导致的AFP。在这个定义下进行的AFP防控工作，已经取得了可喜的成就。从1988年至今，全世界范围内，由PV引起的AFP已经下降了99%[3]。PV引起的AFP在我国曾经广泛流行，是儿童致残和死亡的重要因素[4]。我国的AFP防控工作成效显著，在2000年就进入了无脊髓灰质炎状态[5]。这不仅得益于脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)的广泛使用，更与AFP监测系统的高效工作密不可分。AFP监测系统中，病原的实验室检测工作至关重要，监测系统定义下的AFP的病原体主要是包括PV在内的肠道病毒，本文针对AFP病原体的实验室检测方法进行综述。

1 AFP的病原体

全球范围内的AFP监测研究显示，能引起AFP的病原体主要是肠道病毒(EV)，包括PV和其他非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)[6-7]。肠道病毒属小RNA科，是一个大家族，其基因组是单股正链RNA,含有VP1、VP2、VP3、VP4四个结构蛋白编码区域，分别编码4种结构蛋白，VP1、VP2、VP3位于其表面，决定着血清型，VP4区位于其内部，其核苷酸序列相对保守。在早些年研究当中，研究人员习惯将肠道病毒划分为埃可病毒、柯萨奇病毒、PV以及新型肠道病毒。一直以来，PV在AFP研究领域中扮演重要的角色，在对PV的研究中，世界卫生组织定义了脊髓灰质炎野病毒(WPV)[8]、疫苗高变异脊髓灰质炎病毒(VHMPV)、疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(VDPV)[9]。PV有3个型别，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，其血清型分型和基因分型结果高度一致[10]。随着研究的不断深入，近年来对肠道病毒的分类有了新的标准。基于肠道病毒VP1区，肠道病毒划分为A、B、C、D 4组[11]，按照肠道病毒VP1区序列特点，肠道病毒的基因型多达100多种[12]。越来越多新型别的NPEV被证实能导致AFP,其中最多的是肠道病毒71型(EV71),其次是肠道病毒D68型(EVD68)[13]。近些年的研究发现，PV的减毒疫苗株可以与C组肠道病毒发生重组，PV衣壳蛋白被根除后，其基因组剩余部分可以在其他C组肠道病毒中无限期存活，这就为产生新的能引起AFP的肠道病毒提供了有力进化条件[14]。

2 AFP病原体实验室检测方法

自1988年世界卫生组织提出消灭脊髓灰质炎计划，倡导在全球范围内根除脊髓灰质炎以来[15]，全球AFP监测实验室针对AFP病原体(PV和NPEV)开展了大量的监测工作，各种关于AFP病原体的检测方法大致可分为病毒分离、血清学鉴定方法、聚合酶链反应(PCR)、核苷酸序列测定及分析。

2.1PV和NPEV的病毒分离 病毒分离是病毒性疾病诊断的金标准，在AFP监测工作中，病毒分离也是病原学监测工作的基础，病毒分离得到的高浓度和高纯度的毒株可以应用于其他相关的更深入的研究。我国于1991年开始开展AFP监测工作，在开展AFP监测工作之初，AFP监测实验室使用世界卫生组织推荐的人喉表皮癌细胞(Hep-2)和人横纹肌肉瘤细胞(RD)对AFP病例的粪便标本进行病毒分离。包括PV在内的肠道病毒能在这两种细胞上产生典型的细胞病变(CPE)，通过倒置显微镜直接观察细胞形态就能完成肠道病毒的分离工作。使用RD和Hep-2细胞在进行病毒分离时，这两种细胞均能分离PV和NPEV，但缺乏对PV的特异性，1998年，世界卫生组织推荐了一种新的转人PV受体的小鼠细胞(L20B)来进行PV的分离，同时仍采用RD细胞进行肠道病毒的分离[16]。同一时期的相关研究均表明，使用L20B和RD细胞进行PV和肠道病毒分离时，L20B细胞对PV有着极强的特异性和敏感性，对PV有着更准确的分离效果，但是可能会影响NPEV的分离率[17]。在进行病毒分离的实验中，除了防止实验操作过程中的污染，实验过程中的质量控制也尤为重要，细胞敏感性实验和支原体检测是AFP监测实验室病毒分离工作中常用的质量控制手段[18-19]。在较长一段时间内,AFP监测实验室进行病毒分离的实验中，接种后的RD和L20B细胞都是连续观察7 d，传两代，使用RD细胞和L20B细胞进行病毒分离的实验室检测中，习惯于把L20B细胞分离阳性毒株叫作PV，L20B细胞阴性而RD细胞阳性分离毒株叫作NPEV。从2013年1月1日起，在世界卫生组织推荐下，AFP监测实验室开始实施新的病毒分离流程，新病毒分离流程不但缩短了病毒分离时间，还使用了交叉转种的方法(即RD细胞CPE阳性需转种L20B细胞，L20B细胞CPE阳性需转种RD细胞)，这种方法很大程度上提高了病毒分离物的纯度和浓度[20]。新分离流程还更科学地为病毒分离物进行了定义，经新流程分离后最终L20B细胞CPE阳性后且转种RD细胞CPE阳性称为L20B阳性分离物，是否属于PV需要进一步鉴定。经新流程最终只有RD细胞CPE阳性分离产物仍称作NPEV。AFP监测实验室中病毒分离流程变更情况对比详见表1。

表1 我国AFP监测系统病毒分离流程对比

2.2AFP监测中的血清学方法 在AFP监测的实验室工作中，血清学方法主要被应用在早些年的研究中，并且早些年的AFP研究工作重心在PV上，对NPEV不太重视，较少有对NPEV的研究，因此AFP监测实验室的血清学方法主要针对PV设计。基于血清学方法，AFP监测实验室常开展的实验有PV的血清型鉴定和定型实验、PV IgM抗体测定、脊髓灰质炎疫苗效价测定、人群脊髓灰质炎抗体水平检测实验、交叉吸附血清ELISA实验。PV的血清学鉴定和定型实验是使用PV的3种特异性型别的抗血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按照组合对病毒进行中和实验，其组合方式有:(1)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型组合，(2)Ⅰ、Ⅱ型组合，(3)Ⅰ、Ⅲ型组合，(4)Ⅱ、Ⅲ型组合；然后根据中和实验结果反推待鉴定病毒分离物是否属于PV以及其型别。此方法操作烦琐，且需要建立在病毒分离培养的方法上，目前已被分子生物学鉴定方法替代。PV IgM抗体测定是使用ELISA方法检测AFP病例血清及脑脊液中的特异性IgM，此方法必须在明确患者近期没有接种疫苗的情况下才适用，并且脑脊液的采集相对麻烦，在AFP监测工作中，此实验较少开展。脊髓灰质炎疫苗效价测定实验的主要目的是为了检测和评价疫苗在运输和存储过程中，疫苗效价是否受到影响，该实验操作烦琐，同时需要建立在细胞培养方法的基础之上[21]。人群脊髓灰质炎抗体水平检测实验不是AFP监测实验室的常规检测，此实验主要目的是评价免疫策略的有效性，以及了解人群的免疫水平，进而针对性地制订相关免疫策略[22]。交叉吸附血清ELISA实验是荷兰科学家发明的用于鉴定PV的方法，该方法可区分野毒株和疫苗株[23]，但随着PCR方法的建立，该鉴定方法已经很少被使用。

血清学方法也可以用于NPEV的分型，其原理与PV的分型方法类似，都是依靠病毒分离得到较高浓度和纯度的毒株后，再使用相应的中和抗体进行分型。这种基于血清学分型的方法，可以将NPEV划分为60多个血清型，但血清型分型方法必须依赖于病毒的分离，而相关研究显示，这种鉴定方法实验工作量巨大，存在交叉反应且对某些变异毒株无法定型[24]。因此，在NPEV的鉴定研究中，血清学方法逐渐被分子生物学方法替代。

2.3AFP监测中常用的分子生物学方法 随着分子生物学技术的迅速发展，分子生物学检测方法已经被广泛应用到各个领域。AFP监测领域使用到分子生物学方法的实验有以下几种:聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)实验、实时荧光聚合酶链反应(rRT-PCR)鉴定实验、商品化荧光定量PCR试剂检测、病毒核苷酸序列的测定及分析，这些方法大多基于分子生物学的经典方法——PCR上建立起来的。AFP监测实验室中早期采用PCR-RFLP方法对PV进行鉴定，基于PCR和RFLP两种方法，其原理是先通过PCR对目的片段的扩增，然后使用限制性内切酶对目的片段进行酶切，然后通过电泳观察限制性酶的图谱来分析序列间的差异，进而达到分型鉴定的目的[25]。PCR-RFLP方法进行PV的鉴定时，由于其引物特异性问题，能扩增NPEV，需要先用中和实验对PV定型，而且此实验中要使用到较多限制性内切酶，操作步骤烦琐，已经被新的型内鉴定方法所代替；rRT-PCR鉴定实验是近年来AFP监测实验室广泛开展的实验，此实验包括PV的型内鉴定((ITD)和PV衍生株(VDPV)筛选[26-27]。AFP监测系统中rRT-PCR鉴定实验所使用的试剂盒是由美国疾病预防控制中心(CDC)研发的，其中的型内鉴定 rRT-PCR实验通过多对荧光探针标记的特异性引物，除了能鉴定出PV、WPV和NPEV外，还能快速鉴定PV的型别，并初步判定出PV属于疫苗相似(SL)株或非疫苗相似(NSL)株，VDPV rRT-PCR实验可以将ITD实验中判定的PV-SL核苷酸变异情况进行初步筛查，快速鉴定其是否属于VDPV。由美国CDC研发的rRT-PCR鉴定PV的方法，操作方便、快捷，特异性和敏感性高，重复性好，该方法通过了AFP实验室网络的评估，是世界卫生组织推荐的方法。目前，美国CDC针对全球AFP相关肠道病毒的新特征，不断优化该方法中使用的引物和探针，该方法试剂已升级到5.1版本；近年来，针对PV和NPEV的商品化rRT-PCR检测试剂盒越来越多。商品化的检测试剂操作简单，可同时实现PV和NPEV的检测和分型，但商品化的检测试剂缺乏可靠的评估和有效的质量控制手段，不能用作AFP监测实验室的常规方法，只能作为辅助的鉴定手段。

病毒核苷酸序列的测定及分析，在现阶段病毒学研究中占有越来越重要的地位，其方法学越来越成熟，使用也越来越广泛。一直以来，AFP监测实验室中选用肠道病毒VP1区作为目的基因进行相关研究，包括肠道病毒的检测和鉴定分型等，该方法由OBERSTE等人在1999年建立[28]。基于VP1区的序列特点，AFP研究领域定义了VDPV(即Ⅰ型和Ⅲ型PV，其VP1编码区域与Saibin株比较，变异率>1%且<15%。Ⅱ型PV，VP1编码区域与Saibin株比较，变异率>0.6%且<15%)，在AFP监测工作中，通过VP1区的序列分析，可以确定PV是否属于VDPV，为AFP的防控工作提供科学依据。在NPEV的研究中，VP1区的序列特点被广泛应用于NPEV基因型别的划分，越来越多引起AFP的NPEV被确定型别[1]，VP1区分型还有一个显著的特点就是与血清中和实验方法进行分型的结果具有较好的一致性，因此VP1区分型方法可靠、准确，是最常用的肠道病毒基因分型方法。虽然使用VP1区分型方案一直被视为肠道病毒分型的金标准，但相关研究发现肠道病毒VP1区的变异程度最大，针对VP1区很难设计通用引物，因此，肠道病毒研究领域开始使用相对保守的VP4区进行分型研究[29]。肠道病毒VP4区核苷酸序列全长仅207 bp，相对于VP1区设计引物更容易，实验操作更方便、快捷，可以提高分型效率。在肠道病毒研究中，研究人员发现肠道病毒基因组存在重组现象[30-31]，因此，使用单一片段对肠道病毒进行分型可能不准确，要获得更准确的分型结果必须采用多片段分型方法相结合。随着测序方法的不断成熟，在肠道病毒研究中，研究人员为了确保分型的准确，开展了越来越多的针对肠道病毒全基因组序列的研究[32-33]。随着新一代基因测序技术的不断普及，病毒的全基因组研究已经变得更加简单、易行[34]。

3 展 望

时至今日，在世界卫生组织的极力倡导和全球AFP监测网络实验室的共同努力下，AFP的防控工作已经取得了长足的进展，尤其是对PV引起的AFP的防控。在针对PV的防控工作中，全球范围有效控制了WPV传播，近年报道WPV的国家仅有阿富汗、尼日利亚和巴基斯坦[15]。目前，全球越来越多的国家完成了WPV的封存工作，Ⅱ型PV的封存工作也正在全球范围内按照世界卫生组织全球行动计划(GAPⅢ)的相关要求有序进行[35]。尽管如此，AFP仍然是一项全球范围内的公共健康问题[36],在全球消灭脊髓灰质炎的新阶段，更及时、有效地发现和控制WPV以及VPDV，是世界卫生组织对全球AFP监测网络实验室的最新要求。与此同时，引起AFP的新的病原体不断被发现、识别和研究。首先是NPEV，NPEV是除PV外，导致AFP的重要病原体，在脊髓灰质炎即将被消灭的现阶段扮演着重要角色。NPEV是一个大家族，型别繁多，缺乏有效的疫苗对其进行防控，并且广泛存在于自然环境中，这使得NPEV的防控成为难题和挑战。此外，近些年的一些研究还发现，除肠道病毒外，其他病毒也能引起AFP[37]，这也对AFP监测工作提出了更高要求。但是，有理由相信，随着针对AFP的检测方法多元化以及检测技术的不断提升，在AFP的监测工作中，不仅能将PV研究得更透彻、更深入，也能将除PV以外的其他病原体进行深入的研究，并将其有效地防控。

总之，目前AFP的防控工作取得可喜成绩，AFP监测实验室的检测工作功不可没。作为AFP监测实验室，在肯定自己成绩的同时，应该看到面临的问题和挑战，不断提升实验室的检测技术能力，更好地为疾病的防控提供病原学依据。