miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在类风湿关节炎患者外周血中检测的临床意义*

钟丽红，丘创华，彭紫元，佘吉佳

广东省深圳市第二人民医院：1.干部保健科；2.检验科，广东深圳 518000

类风湿关节炎(RA)是一种常见的全身性自身免疫性疾病，主要特点为对称性、慢性的滑膜关节炎和关节病变。目前，RA发病机制尚未明确，主要认为是由外界环境因素(感染因素)与自身内在因素(遗传、内分泌因素)导致自身免疫功能紊乱而引起的[1]。同时，RA缺乏有效的治疗手段，只能缓解炎症，延缓病情发展，所以早期的诊断和治疗十分重要。2010版RA诊断标准虽然能够诊断出更多不典型的RA，但由于存在血清学指标不灵敏的对称性关节炎、自限性关节炎和影像学表现不显著的关节炎，误诊和漏诊现象仍然存在。因此，寻找有诊断价值的新分子标志物刻不容缓。

miRNA是一种内源性非编码RNA，长约22个核苷酸，是人体内重要的调节器，能调节细胞周期、免疫功能及新陈代谢等生物过程。近年来，miRNA在人类疾病中的作用引起了广泛的关注，已有研究表明，miRNA的异常提示自身性免疫疾病的发生，miRNA的表达能调控炎症因子的分泌，研究者认为他们可能参与RA新的调控机制[2]，但迄今尚无大量研究证实。miRNA几乎存在于人体的所有体液中，如血清、血浆[3]，目前发现miRNA能够在血液循环中稳定存在，不会被核糖核酸酶(RNase)降解，并且可被计量。故miRNA很有潜力成为一种稳定的、敏感的分子标志物，可能对RA诊断有一定的价值。为了验证miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在RA诊断中的作用，本研究通过实时荧光定量PCR检测RA患者外周血中的miRNA-16、miRNA-146a和miRNA-223的相对表达量，观察这3项指标在RA患者和健康人群之间的差异性；并且与目前临床上常规应用的RA诊断指标[28处关节疾病活动度评估(DAS28)、类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)]进行相关性分析，构建受试者工作特征曲线(ROC曲线)，通过分析曲线下面积(AUC)进而比较miRNA-16、miRNA-146a和miRNA-223单独及三者联合检测诊断RA的灵敏度和特异度，为RA的发病机制研究和临床诊断提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 68例RA确诊患者来自2017年4月至2018年10月深圳市第二人民医院风湿科门诊以及住院患者，其中男17例、女51例，年龄28～65岁、中位年龄46.5岁。健康对照组为同期体检健康志愿者20例，其中男7例、女13例，年龄25～64岁、中位年龄44.54岁。以上参与者均排除其他自身免疫性疾病和重要器官系统疾病，同时未使用过糖皮质激素及其他免疫抑制剂药物治疗。

1.2主要材料与试剂 反转录试剂盒(丹麦，Exiqon公司)，实时荧光定量PCR仪(美国，ABI公司)，全自动生化分析仪(意大利，Vital Diagnosis公司)，微量核酸蛋白仪(美国，Thcmo Scictific公司)，低温高速离心机(美国，Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1实时荧光定量PCR测定miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223 mRNA表达水平 采集RA患者、健康志愿者的空腹静脉血5 mL于EDTA抗凝管中，以3 000 r/min离心5 min后取血浆。根据试剂盒说明书，提取血浆总RNA，利用微量核酸蛋白仪测定RNA纯度判断是否符合实验要求，RNA经过反转录取得cDNA，cDNA作为模板进行荧光定量PCR检测。以U6 小核RNA作为内参,根据引物序列进行设计。在实时荧光PCR仪进行定量检测。数据采用2-ΔΔCt法分析miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223表达相对值，ΔΔCt目的基因=ΔCt目的基因-ΔCtU6。U6 snRNA上游检测引物为TTC GTG AAG CG TCC ATA TTT T ACA CTC；miRNA-146a上游检测引物为 CAG CTG GGT GAG AAC TGA ATT CCA TGG GT；miRNA-223 上游检测引物为ACA CTC CAG CTG GGT GTC AGT TTG TCA AAT；miRNA 16 上游检测引物为ACA CTC CAG CTG GGT AGC AGC ACG TAA ATA TT。

1.3.2DAS评分 DAS28评分细则如下。(1)压痛关节数：共检查28 个关节，包括掌指关节、肩关节、膝关节、两侧近端指间关节、肘关节、腕关节，计算关节触痛数；(2) 肿胀关节数：检查上述28个关节是否出现肿胀，记录肿胀关节数；(3)测定红细胞沉降率(ESR)；(4)最近7 d患者健康状况或患者对RA病情活动的总体评价:采用0～10 cm 标尺，0表示病情无活动，10表示病情极度活动，中间部分表示 RA不同程度的病情活动，数字越大表示病情活动性越强。DAS28=(0.56×压痛关节数+0.28×肿胀关节数)×1/2+0.70×Ln(ESR)×1.08+1.06。

1.3.3RF、CRP的检测 采用贝克曼2700全自动生化分析仪，免疫速率散射比浊法测定RA患者RF、CRP的水平。

2 结 果

2.1RA患者及健康对照组miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相对表达水平比较 RA组患者外周血中miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相对表达水平均显著高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在 RA组及健康对照组的相对表达水平

注：与健康对照组相比，#P<0.05。

2.2RA活动组、缓解组及健康对照组之间miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相对表达水平比较 根据DAS28评分，进一步把RA组分为活动组和缓解组，每组34例。结果显示活动组miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相对表达水平高于缓解组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。缓解组miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相对表达水平与健康对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 RA活动组、缓解组与健康对照组间miRNA-16、 miRNA-146a、miRNA-223的相对表达水平

注：与健康对照组相比，#P<0.05；与缓解组相比，*P<0.05。

注：1～4分别为miRNA-1、miRNA-146a、miRNA-223、三者联合使用的ROC曲线。

图1 miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223及三者联合诊断RA的ROC曲线

2.3miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的表达与 RA 患者RF、CRP及DAS28评分的相关性分析 经检测，RA患者的RF水平为(35.74±9.28)IU/mL，CRP水平为(11.58±2.49)mg/L，DAS28评分为(4.17±1.06)分。Pearson分析的发现，miRNA-16与CRP、DAS28存在正相关关系(r>0,P<0.05)。miRNA-146a与CRP、DAS28存在正相关关系(r>0,P<0.05)。miRNA-223与RF、CRP存在正相关关系(r>0,P<0.05)。见表3。

表3 miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的表达与 RF、CRP及DAS28的相关性

2.4miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的表达水平对RA的诊断效能 单独使用miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223作为诊断RA的标志物，得到AUC分别为0.63、0.75、0.89，灵敏度分别为68.70%、85.24%、87.63%，特异度分别为55.39%、63.57%、90.35%。三者联合使用作为诊断RA的标志物，得到AUC为0.91，灵敏度为89.34%，特异度为91.56%。见图1。

3 讨 论

目前，RA的诊断标准由美国风湿病学会(ACR)1978年修订，通常达到此标准的患者的疾病已经发展到一定程度，甚至出现了不可逆的病理改变。后来，ACR联合欧洲抗风湿联盟(EULAR)提出新的 RA分类标准和评分系统。新标准加入了新的血清学指标，对及早诊断RA有一定帮助但并不纳入诊断指标。目前监测RA的指标主要为实验室指标RF、CRP和临床指标DAS28。DAS28评分作为目前临床最好的综合指标，主要用于监测RA病情活动度及评定药物有效性，但评价方法复杂不便于广泛应用。RF是在RA相关抗原的刺激下由免疫细胞分泌的自身抗体，CRP是由于关节炎症引起分泌异常的一种急性时相反应蛋白。RF、CRP的检测操作虽简单，均在评定患者健康状况、组织病变状况等方面起重要作用，但其他自身免疫性疾病患者也存在RF分泌异常，而CRP仅存在于急性炎症时期，故应用RF、CRP、DAS28早期诊断RA存在一定的局限性。近年来，miRNA被认为是免疫功能及炎性反应发生过程的参与者[4]，miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223有希望成为RA早期诊断及预后评估的新型分子标记物，然而目前尚无大量研究证实其实际的诊断价值。

miRNA在人体内广泛分布于外周血和组织细胞中，有研究表明，外周血中的miRNA能在室温的条件下过夜，并且能经受反复冻融、高温等操作，在过酸、过碱的条件下也能稳定存在，同时，组织和外周血中的miRNA具有相同的改变趋势[5]，说明外周血中miRNA替代组织活检成为新型生化指标的可能。近年来，miRNA在RA的研究中所扮演的角色越来越重要。miRNA-16是一类在淋巴疾病中广泛表达的miR-15/16簇，能通过负反馈环调节NF-κB信号通路进而发挥抑制细胞凋亡的作用[6]。WANG等[7]应用qRT-PCR法检测到RA患者外周血中miRNA-16、miRNA-21、miRNA-451、miRNA-223表达水平显著升高。CASTRO-SANTOS等[8]的研究表明，外周血中的miRNA-16水平能够区分健康人、骨性关节炎(OA)患者及RA患者，且在RA患者的外周血中明显上升。miRNA-146a是miRNA-146中的一种亚型。研究显示miRNA-146a来源于CD4+T细胞，并在滑膜成纤维细胞、外周血单核细胞以及关节液中高表达。同时，miRNA-146a参与抑制 RA滑膜成纤维细胞的炎性反应，主要通过下调 IRAK-1的表达来抑制滑膜成纤维细胞的增殖和分泌 IL-8、IL-6等炎症因子发挥作用[9]。刘琴等[10]采用qRT-PCR检测活动期RA患者和缓解期RA患者血清中miRNA-146a的表达水平，结果显示活动期RA患者血清miRNA-146a水平显著高于缓解期RA患者及健康人(P<0.05)，认为血清miRNA-146a水平可作为活动期RA的诊断指标。冯知涛等[11]检测RA患者及健康人外周血单核细胞(PBMs)中miRNA-146a、miRNA-16的表达，发现RA患者miRNA-146a、miRNA-16的表达显著高于健康人，且miRNA-146a、miRNA-16表达与CRP、ESR和DAS28评分呈正相关关系。miRNA-223作为参与调节破骨细胞分化的潜在分子标记物，提示miRNA-223可能与RA患者关节的不可逆性损伤有关。MURATA等[12]证实miRNA-223通过抑制胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的分泌来干预炎症相关因子IL-10的产生，由此可知 miRNA-223能调控炎症相关因子的分泌从而参与 RA的免疫反应过程。在治疗时间较久的RA患者外周血中miRNA-223的水平与治疗时间较短的RA患者相比，明显下降[13]，说明miRNA-223能在一定程度上反映治疗效果。

本试验结果与上述研究结果一致，RA患者外周血中的miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相对表达水平显著高于健康对照组，提示miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在RA患者外周血中异常高表达，这3项指标有潜力应用于辅助鉴别健康人群和RA患者。另外，本研究发现RA活动组miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相对表达水平均显著高于RA缓解组，miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223与RA常用诊断指标RF、CRP，以及反映RA活动度的DAS28评分存在一定的相关性，所以笔者推断外周血miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223与RA的活动度相关，可能参与疾病的发生、发展。为观察这3项指标作为RA诊断标志物的灵敏度和特异度，本研究建立了miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223单独检测及联合检测的ROC曲线。结果显示，单独检测这3项指标作为RA标志物时,miRNA-223的AUC、灵敏度和特异度在三者中最高，而联合使用三者作为RA标志物时，AUC、灵敏度和特异度较单独使用时高，说明miRNA-146a、miRNA-223、miRNA-16联合检测诊断RA的效能较好。

综上所述，miRNA-146a、miRNA-223、miRNA-16有利于诊断RA，取样方便、安全，可作为临床辅助诊断方法。