利用cDNA-AFLP技术分析炭疽菌危害诱导茶树的差异表达基因

魏日凤，赖建东,4，彭成彬，张承康，连玲丽，刘伟,*

利用cDNA-AFLP技术分析炭疽菌危害诱导茶树的差异表达基因

魏日凤1，赖建东1,4，彭成彬1，张承康2，连玲丽3*，刘伟1,2*

1. 福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2. 宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100；3. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；4. 湖北科技学院，湖北 咸宁 437100

应用cDNA-AFLP技术筛选炭疽菌（sp.1）危害诱导茶树毛蟹品种（cv.）的差异表达基因，为探究茶树抗炭疽菌的分子机制奠定基础。利用256对选择性扩增引物组合分析病菌接种后0 h和48 h的叶片cDNA，经筛选、测序和BLAST比对获得136条差异表达片段（TDFs）。同源基因功能分析结果表明，128条TDFs与Nr数据库已有基因同源，其功能以胁迫响应、生物调控与信号转导为主；其中51条TDFs与TPIA数据库中冷害、干旱、盐碱条件下的差异表达基因高度同源。进一步对27条TDFs进行qRT-PCR验证，结果显示，有24条TDFs的表达情况与cDNA-AFLP的结果一致，WRKY转录因子、乙烯响应转录因子、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗逆相关基因的表达显著上调。本试验通过筛选获得差异表达的抗逆相关基因，为后续的基因功能研究奠定基础。

茶树；炭疽菌；cDNA-AFLP；差异表达基因

由刺盘孢菌引起的茶炭疽病是危害茶叶生产的一种重要病害，对南方茶区尤其是高湿低洼茶园造成了严重的经济损失[1-2]。梅雨和秋雨时节该病害的大面积蔓延，除了导致茶叶的大量减产，更影响茶叶品质。选育和种植抗病品种是防治这类病害最经济、安全、有效的措施。但现有许多茶树栽培品种对炭疽病菌高度感病[3]，抗病品种资源的缺乏加大了传统育种的难度。近年来，结合分子生物学技术挖掘植物重要抗病基因，并利用分子标记筛选技术选育抗病品种，已成为植物抗病研究的热点[4]，也为茶树病害控制提供了一条新的研究思路。因此，基于分子技术开展茶树抗炭疽病的机制研究对茶树抗病品种选育及茶叶食品安全具有重要意义。

目前，对茶树响应炭疽病菌侵染的抗病机制研究仍然较少。杨光道[5]从生理生化角度研究了安徽省油茶主栽品种对炭疽病的抗性机制，发现苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化物酶（POD）活性在不同品种中均明显增强。王玉春[6]检测感病和抗病品种接种炭疽菌后叶片内活性氧（ROX）、过敏性坏死点（HR）、咖啡碱含量的变化，发现三者均在抗病品种的抗病过程中起重要作用；同时，其针对抗病差异表达基因的分析表明，植物激素和咖啡碱合成代谢与茶树抗炭疽病有关。赖建东等[7]在前期研究中对炭疽病菌侵染后茶树叶片的生理指标及基因表达变化进行检测，结果表明超氧化物歧化酶（SOD）、POD和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性及相关基因的表达均出现了上调的变化，暗示了自由基清除在茶树抗病中扮演重要角色。尽管以往的研究已从生理、生化及分子的水平上对抗病机制进行了较为深入的探讨，也得到了一些很有意义的结论，但这些研究对茶树炭疽病菌互作机制的解析仍不够完善。因此，有必要结合其他分析技术从不同角度反映茶树响应炭疽病菌侵染的分子变化，为全面探明茶树抗病机制奠定基础。

cDNA-AFLP技术作为一种鉴定差异表达基因的有效工具，具有假阳性低、多态性高、不依赖于基因组数据等优点，已被成功用于多种植物抗病差异基因的筛选，如小麦抗条锈病[8]、辣椒抗疫霉[9]、菜心抗小菜蛾[10]等。该技术在茶树相关研究领域也有所应用，曹士先等[11]率先利用cDNA-AFLP筛选茶树叶片被茶尺蠖取食后的差异表达片段，从中鉴定得到4.5%直接与抗病防御相关的序列，证实了cDNA-AFLP技术在茶树抗病机制研究中的可行性。因此，本研究将基于该技术分析炭疽病菌侵染前后茶树叶片的差异表达基因，以期从分子水平探讨茶树响应炭疽病菌胁迫的分子防御机制，为后续的抗病基因功能研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茶叶为福建农林大学南区茶山试验基地毛蟹茶叶品种；供试炭疽病原菌强致病菌株ZRG由福建农林大学茶叶科技与经济研究所提供。

1.2 接种取样与RNA提取

采用张新春等[12]的炭疽菌接种方法，选取露天茶园生长两年以上的健康茶苗，将PDA平板上培养7 d的炭疽菌菌饼以菌面朝下的方式接种于茶苗的第二三叶，按采样时间点分别选取8株，每株选取5个叶片进行接种，接种期间茶树生长温度为20~28℃，接种后0 h和48 h摘取处理过的叶片样品，并置于液氮中速冻，于–80℃保存备用。使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取叶片总RNA，不同时间点的样品RNA分别提取3次，进行混样以减少误差。用1%琼脂糖电泳检测提取效果。

1.3 cDNA-AFLP分析

取不同样品的等量RNA，参照cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）说明书合成cDNA。AFLP分析参照Bachem等[13]的方法对cDNA产物进行酶切、预扩增和选择性扩增。所用引物和接头参照郭朋[14]的方法，由16条EcoR I（E11—E14、E21—E24、E31—E34和E41—E44）和16条Mse I（M11—M14、M21—M24、M31—M34和M41—M44）引物组合，共256对引物用于选择性扩增。取7 μL选择性扩增产物于95℃变性处理5 min后，加至6%聚丙烯酰胺变性凝胶上，以50 W恒功率电泳约2~3 h，直至蓝色指示带接近胶底时停止。参照文献[14]的方法对凝胶进行银染，染色约30 min，显影晾干后，于凝胶成像系统下观察，结合成像系统的条带灰度数值，将有明显差异的条带选出，用于后续的差异片段分析。

1.4 基因差异片段回收、克隆及测序分析

基因差异片段割下后，置于30 μL ddH2O中煮沸10 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液作为第二次PCR扩增的模板。吸取8 μL回收的cDNA模板，加入2 μL EXX引物（10 pmol·μL-1）、2.5 μL MXX引物（10 pmol·μL-1）、0.5 μL Taq酶（5 U·μL-1）、2.5 μL Taq Buffer、2 μL dNTP（2.5 mmol·L-1）和7.5 μL ddH2O，混匀后，置于伯乐T100 PCR仪进行扩增。PCR反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 2 min，40个循环；72℃ 7 min最终延伸。扩增产物经1%琼脂糖检测后，用琼脂糖胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）回收；连接pMD 18-T Vector（TaKaRa）转化，选取阳性质粒送由铂尚生物技术有限公司测序。测序结果经NCBI数据库的BLAST比对工具确定相似序列，并结合TPIA数据库（Tea Plant Information Archive，http://tpia.teaplant. org/ index.html）表达谱数据[15]计算这些茶树同源序列在其他逆境条件下的差异表达倍数，取logFC≥1的差异基因用于了解同源序列的表达情况。

1.5 差异基因的qRT-PCR验证

2 结果与分析

2.1 RNA提取及cDNA合成

对提取的总RNA进行电泳分析，由图1-A可以看出，总RNA样品中有两条清晰的条带，分别为28 S和18 S条带。经核酸定量仪检测后得到RNA的A260/A280和A260/A230数值均在2.1左右，表明其质量和纯度较好。逆转录产生的cDNA为300~2 000 bp的弥散条带（图1-B），说明cDNA质量良好，适合用于后续试验。

2.2 cDNA-AFLP分析

通过对cDNA进行AFLP分析，获得的预扩增片段在250~2 000 bp之间（图2-A），且弥散均匀，适合用于后续的选择性扩增。以16条EcoR I和16条Mse I引物组合，共256对引物组合对接种0 h和接种48 h的茶树叶片样本的预扩增产物进行选择性扩增。以E14和M组合的16对引物扩增结果为例（图2-B和图2-C），可知扩增产物具有良好的多态性。

表1 荧光定量PCR所用引物

图1 不同接种时间样品的RNA和cDNA电泳图

采用6%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离选择性扩增产物，每对引物的扩增产物大致包括50个条带，片段大小在100~1 000 bp。不同引物的扩增结果总体上较为一致，具有良好的平行性，适合用于样品间的比较。以E14和M组合的16对引物的扩增产物为例（图3），两个处理时间段（0 h和48 h）的样品扩增产物中的多数条带的亮度相近，部分条带的亮度差别明显（如图3矩形框所示），表明炭疽病菌侵染引起了茶树叶片基因表达量的变化。将这些差异条带切取回收，共获得197条差异条带，其中上调表达148条，下调表达49条。

注：M：Marker。（A）预扩增电泳结果，（B）接种后0 h的选择性扩增电泳结果，（C）接种后48 h的选择性扩增电泳结果

图3 E14和M组合的16对引物扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

2.3 差异条带的序列分析

对选取的197条差异条带（TDFs）进行克隆测序和BLAST比对分析，除去比对结果中E值小于10-6的条带和重复条带，得到136条TDFs，其中100条表现为上调表达（Up-TDFs），分别将其命名为U1—U100；36条表现为下调表达（Down-TDFs），分别命名为D1—D36。

通过编码区注释和同源基因功能分析，去除8条仅含UTR区域的序列，将剩余的128条TDFs分为10类，列于表2。这些TDFs同源基因的功能涉及胁迫响应、生物调控、碳水化合物和能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢等，其中以胁迫响应、生物调控与信号转导的基因最多，分别占总数的25.0%和19.5%。与此同时，绝大多数功能类别的上调TDFs在数量上明显多于下调TDFs，如胁迫响应、蛋白代谢等，表明炭疽菌危害对茶树组织中这些功能类别的基因调控以激活为主；某些功能类别如糖类与能量代谢的情况则相反，表明病菌危害可能抑制了相关的代谢过程。

表2 TDFs的同源性比对分析及功能分类

注：*表达谱数据显示的是TIPA数据库不同逆境条件下基因上调或下调的情况，其中drought、cold、salt和MeJA分别代表干旱、冷害、盐碱和茉莉酸甲脂等诱导条件，括号内的数字代表上调或下调的logFC倍数值，正值代表上调，负值代表下调

Note: The expression profile exhibited the expression levels of differential expressed genes under different conditions compared with normal condition based on data in TIPA database. Drought, cold, salt and MeJA represent 4 different conditions. The figures between brackets represent logFC values, and positive and negative values represent up and down-regulated

续表2

续表2

续表2

将差异表达TDFs与茶树信息检索TIPA数据库的基因进行相似性比对，结果表明（表2），110条TDFs与茶树基因组的序列具有较高的相似性（E值≤10-3），其中51条TDFs的相似基因序列在盐碱、干旱、冷害等逆境胁迫或茉莉酸甲脂诱导条件下出现表达量的显著变化，表明这些TDFs可能在茶树对抗生物胁迫和非生物胁迫中起重要作用。

2.4 部分差异条带qRT-PCR验证分析

随机选取27条TDFs进行qRT-PCR验证，结果显示24条TDFs在病菌接种后48 h的表达情况与cDNA-AFLP图谱的结果一致，另外3条TDFs的表达情况不一致（U5、U13和U67），一致率为88.9%。可见cDNA-AFLP获取的基因表达结果较为可靠。

在qRT-PCR验证为上调表达TDFs中，U20、U25、U31、U38、U46、U67、U70、U75、U79、U80、U81、U84等12条TDFs的相对表达量值几乎都处于0~10之间，上调幅度相对较小（图4-A）。其中，多数TDFs的相对表达量在病菌接种后24 h达到最大值，而U25（编码超氧化物歧化酶）和U81（编码水通道蛋白）的相对表达量在病菌接种后48 h达到最大值，表明两者可能在茶树抗病中发挥更持久的作用。结合表2中这些TDFs的茶树同源基因在非生物逆境下的表达情况来看，U46（编码漆酶）的同源基因TEA027461.1在盐碱、干旱和冷害条件下均上调表达，表明其可能是生物与非生物胁迫下茶树通用的抗性基因，而U20（编码G-box结合因子）的同源基因TEA013552.1在干旱和冷害条件下，及U25（编码超氧化物歧化酶）的同源基因TEA004714.1在干旱条件下却是下调表达，与本试验的结果相反，说明它们有可能在生物与非生物胁迫情况下发挥不同功能。

在qRT-PCR验证为上调表达TDFs中，U2、U26、U43、U56、U65、U68、U77和U95这8条TDFs的相对表达量最大值均高于10，上调幅度较大（如图4-B所示）。其中，U65（编码乙烯反应转录因子）、U68（编码过氧化物酶）、U77（编码WRKY转录因子）和U95（超氧化物歧化酶）表达上调幅度显著，它们分别在病菌接种后24 h时上调56.3倍、81.5倍、212.8倍和17.7倍。结合表2的茶树同源基因表达数据可知，U43（编码受体蛋白激酶）、U56（编码WRKY转录因子）、U65、U68和U77的同源基因（TEA024197.1、TEA011154.1、TEA031293.1、TEA028180.1和TEA005142.1）在冷害胁迫下均为上调表达，表明这些TDFs可能是茶树病害和冷害胁迫响应中均起关键作用。

在qRT-PCR验证为下调表达的7条TDFs（图4-C）中，U5（编码假定耐盐性蛋白）和D25（编码脱水应答蛋白）的下调幅度最大，分别在病菌接种后24 h时下调6.3倍和病菌接种后48 h时下调12.4倍，表明两者的表达均受到明显的抑制。从7条TDFs的同源基因来看，D25、D11和D23的茶树同源基因（TEA032499.1、TEA021973.1和TEA026009.1）在冷害胁迫下也表现为下调表达；D25和U5的同源基因（TEA032499.1和TEA007942.1）在干旱胁迫时下调表达。

注：（A）表达量上调幅度较小的TDFs，（B）表达量上调幅度较大的TDFs，（C）表达量下调的TDFs

3 讨论

从转录组水平分析差异表达基因的研究技术很多，包括消减杂交、mRNA差异显示PCR、基因芯片技术、cDNA-AFLP、基因表达系列分析（SAGE）及基于新一代测序技术的RNA-Seq技术等。其中cDNA-AFLP、芯片技术、SAGE和RNA-Seq技术均可对生物转录组进行大规模的系统分析。相比之下，cDNA-AFLP出现较早，具有操作简单、不依赖于特殊仪器、实验成本低、灵敏度较高、特异性好等特点[17]，被广泛应用于真核生物的特异表达基因分离研究中[18]；而后续出现的芯片技术和RNA-Seq技术在覆盖度、灵敏度和精确性等方面明显优于cDNA-AFLP技术，它们在差异基因研究中发挥着越来越重要的作用。然而，芯片技术和RNA-Seq技术同样存在一些问题，如较高的假阳性、数据量大及非模式物种注释信息有限影响数据有效分析、实验费用昂贵等[19]。因此，本试验在综合考虑实验成本、茶树基因组信息较少等具体情况的基础上，选择cDNA-AFLP技术挖掘炭疽菌胁迫下茶树的差异表达基因。在具体实施过程中，经过多次扩增筛选，获得稳定性较好的差异表达基因片段用于测序分析。从分析结果来看，差异表达基因涉及8类主要的生物过程，其中胁迫响应、生物调控和信号传导、蛋白代谢等生物过程的上调表达基因最多，表明炭疽菌危害激活了茶树组织中防御相关的代谢过程。这与Wang等[20]利用转录组技术挖掘果生炭疽菌（）危害诱导茶树的差异基因主要富集于糖类代谢、植物激素、活性氧反应、生物刺激和信号传导等生物过程的试验结果较为一致。

MAPK级联途径作为重要的信号转导通路，参与植物的抗病反应。在Wang等[20]的研究中发现了7个MAPK基因受果生炭疽菌诱导，说明MAPK在茶树对抗炭疽菌侵染的过程中起重要作用。在本试验的胁迫响应相关TDFs中也存在不少表达量上调的MAPK基因片段，如非活性受体激酶（U18）、类受体蛋白激酶（U19）、受体蛋白激酶TMK1（U43）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类BLUS1（U79）等。其中，U43基因片段表达量的上调幅度最大，在病菌侵染后24 h上调了11.4倍。对U43的同源基因TEA024197.1的表达情况进行考察，发现其在冷害和干旱条件下分别呈现上调和下调两种不同的表达模式，推测U43可能在茶树对抗生物与非生物胁迫中发挥多向调节作用。

以往的研究表明，茶树受轮斑病菌和果生炭疽病菌侵染时，与过敏性反应和活性氧产生有关的基因呈现上调表达[20-21]。在本试验的胁迫响应类TDFs中也出现了编码热激蛋白（U55和U74）、过氧化物酶类和超氧化物歧化酶的相关基因片段。不同的是，前人的研究报道中与活性氧产生有关的基因主要是过氧化氢酶[20]和过氧化物酶[21]基因，而本试验中检测到的则是过氧化物酶（U68）、谷胱甘肽过氧化物酶（U27）、抗坏血酸盐过氧化物酶（U85）及超氧化物歧化酶（U25和U95）的基因。这种差别是否与不同试验选择的病菌菌株、寄主品种不同有关，有待进一步探讨。

研究报道，ERF、MYB、bHLH和WRKY等抗逆相关转录因子在茶树响应低温和茶尺蠖胁迫中发挥着重要作用[22-23]。在本试验的生物调控和信号转导类TDFs中，编码抗逆相关转录因子的基因均上调表达，其中，转录因子WRKY（U56、U77）和ERF（U65）基因的表达量上调幅度显著，表明相关转录因子参与了茶树响应炭疽菌胁迫的生物调控。在后续的分析中，我们将基因片段U56和U77分别与拟南芥WRKY基因进行聚类分析，发现U56与AtWRKY40、AtWRKY18和AtWRKY60聚在同一分支，而U77则与AtWRKY6、AtWRKY31和AtWRKY42聚在同一分支内。研究证实AtWRKY40、AtWRKY18和AtWRKY60协同参与拟南芥对丁香假单胞菌和灰霉病菌的防御响应调控[24]；而AtWRKY6在拟南芥衰老调控及抗病防御响应中起关键作用[25]。因此，U56和U77基因片段对应的WRKY基因在茶树抗炭疽病中的调控功能值得进一步研究。

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陈宗懋院士团队科研成果荣获国家科学技术进步奖二等奖

2020年1月10日，2019年度国家科学技术奖励大会在人民大会堂隆重举行，由《茶叶科学》编辑委员会主任主持完成的研究成果——

陈院士科研团队在国际上首次提出以茶汤中的残留量作为制定茶叶中MRLs（最大残留限量）的原则，并被国际食品法典农药残留委员会、欧洲食品安全局等国际官方机构认可，重构了茶叶中MRLs制订的国际规范。依据该原则，制修订了6项国际标准，实现了我国制定农产品国际MRLs标准零的突破，避免了在欧盟和美国市场20%~30%的茶叶贸易损失。

项目成果在全球得到应用，提升了我国标准制定的国际话语权，推动了我国茶产业绿色发展的科技进步。MRLs制定规范已应用于国际权威制标机构，制修订的标准被印度、斯里兰卡、肯尼亚等产茶国应用。茶园农药合理选用使用、污染物控制技术已在我国全国18个产茶省推广应用，近3年累计推广超2712万亩，为我国茶叶质量合格率实现从80年代的60%到2018年97.2%的跨越式提升提供了重要保障。

cDNA-AFLP Reveals Differential Gene Expression Profiles of Tea Plant (cv.) Induced bysp.1 Infection

WEI Rifeng1, LAI Jiandong1,4, PENG Chengbin1, ZHANG Chengkang2, LIAN Lingli3*, LIU Wei1,2*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China；2. Ningde Normal University, Ningde 352100, China; 3. College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 4. Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China

Differentially expressed genes related tocv.againstsp.1 infection were screened by cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length polymorphism) to provide reference for further illustrating the molecular mechanism underlying tea resistance to anthracnose. A total of 256 pairs of selective primers were applied to amplify the cDNA of leaves collected at 0 h and 48 h afterinfection, and 136 differentially expressed transcript-derived fragments (TDFs) were obtained via screening, sequencing and BLAST analysis. The analysis of the homologous genes revealed that 128 TDFs were homologous with the known genes in Nr database. Most of them were related to stress responses, biological regulation and signal transduction, and 51 TDFs were highly homologous to differential expressed genes of tea plant under cold, drought or salt conditions in TPIA database. Further qRT-PCR analysis of 27 TDFs showed that the expression profiles of 24 TDFs were consistent with those of cDNA-AFLP results, among which several resistance-related genes including WRKY transcription factor, ethylene-responsive transcription factor, peroxidase and superoxide dismutase were significantly up-regulated. The differential expressed genes found in this study would lay a foundation for further analysis of their functions.

sp.1, cDNA-AFLP, differential expression genes

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2020)01-026-13

2019-04-02

2019-06-04

福建省“2011协同创新中心”中国乌龙茶产业协同创新中心专项（闽教科[2015]75号）、福建省科技厅高校产学项目（2016N5010）、宁德师范学院科研发展资金项目（2016FZ30）、宁德师范学院协同创新中心资金项目（2017Z02）

魏日凤，女，实验师，主要从事茶叶品质与提升方面的研究。

lianll2002@163.com，liuwei0591@126.com