3种根管冲洗液对牙髓炎根管渗出液中基质金属蛋白酶水平的影响

王丽琴,荆得宝,朱 静,焦红卫

(1.上海市口腔病防治院分院口腔内科,上海 200031; 2.上海市浦东新区公利医院口腔科,上海 200135; 3.上海市口腔病防治院特需门诊,上海 200031)

基质金属蛋白酶(MMPs,matrix metalloproteinases)是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族,可降解基底膜和细胞外基质的大多数蛋白质,其分为五大类:胶原酶、明胶酶、基质降解素、膜型MMPs以及结构和功能比较特殊的MMPs[1-2]。基质金属蛋白酶与口腔多种疾病有着密切的关系。MMPs通过降解牙本质的胶原参与龋病的发展,并与牙髓炎、根尖周炎的发生发展有着密切关系[3]。体外研究发现,在炎症因子的刺激下,牙髓细胞能够合成的MMPs有:MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MT1-MMP、MMP-20和MMP-28[4-6]。生理条件下MMPs 的水平较低,其与TIMPs的平衡维持着牙髓组织的健康,牙髓组织在炎症状态下,MMPs的水平显著增高。通过检查龋洞内牙本质液MMP-9的含量,在不可逆牙髓炎患牙牙本质液中可检出较高含量的MMP-9,健康对照样本中未能检出MMP-9,提示牙髓炎可致牙髓组织MMP-9水平升高[7]。Evrosimovska等[8]通过对比慢性牙髓炎组织和正常牙髓组织中MMP-1,MMP-8,MMP-13的水平,发现炎症组织中MMPs水平显著升高。提示MMPs参与牙髓炎症的发展,与炎症过程中细胞外基质的破坏密切相关。

研究拟探讨临床常用的3种根管冲洗液对炎症牙髓组织中基质金属蛋白酶MMP-8、MMP-9、MMP-2水平的影响。希望藉此了解临床常用根管冲洗液对与牙髓炎密切相关的MMPs的影响。

1 研究对象和方法

1.1 材料和仪器

材料:人MMP-8、MMP-9、MMP-2ELISA试剂盒(武汉新启迪生物科技公司,中国);2%氯己定(锦州药业有限公司,中国);1%次氯酸钠(南昌普阳科技有限公司,中国);3%双氧水(江西健保医药科技有限公司,中国)。

仪器:离心机(Sorvall LengendRT型低温离心机,德国);酶标仪(Bio-Rad,美国)。

1.2 研究对象的选择

选择诊断为牙髓炎需根管治疗的患牙40例。标准:无系统性疾病,近3个月未使用抗生素及免疫制剂,牙周袋<3 mm,能够配合完成根管治疗。

1.3 实验方法

(1) 患者随机分为4组,分别为氯己定组、次氯酸钠组、双氧水组、对照组(生理盐水组)。氯己定组处理方式:根管预备期间采用5 mL 2%氯己定溶液冲洗。次氯酸钠组处理方式:根管预备期间采用5 mL 1%次氯酸钠溶液冲洗。双氧水组处理方式:根管预备期间采用5 mL 3%双氧水溶液冲洗。生理盐水组:根管预备期间采用5 mL 0.9%生理盐水溶液冲洗。

(2) 患牙常规上橡皮障,去除腐质,开髓,去除冠髓,手用K锉扩通根管至25#,吸潮纸捻取样。常规机用镍钛挫扩挫,根管冲洗液冲洗,干燥,再次吸潮纸捻取样。

(3) 根管渗出液提取方法:用25号吸潮纸尖放入根管内,达到工作长度,放置30 s,迅速拿出放回至消毒EP管内,重复取3次。样品置-70 ℃低温冰箱存贮。

(4) 样品检测,ELSA检测MMP-8,MMP-9,MMP-2水平。

1.4 样本处理

(1) 将放置试纸条的离心管加入500 μL的pH 7.2 0.1 M的PBS,反复冲洗吹打,最后离心10 000 转15 min,取上清备用。

(2) 样品采用双抗体夹心ABC-ELISA法进行检测,依照试剂盒说明进行样品检测。最后通过绘制标准曲线求出标本中MMP-8,MMP-9,MMP-2的浓度。

1.5 统计学分析

数据采用SPSS 19.0统计软件统计完成。采用配对样本进行t检验,P<0.05有统计学意义。

2 结果

(1) 3种根管冲洗液对MMP-9水平的影响 统计结果显示不同根管冲洗液对MMP-9水平具有影响。数据表明治疗后MMP-9浓度均较治疗前降低,4组差别均有统计学意义,其中氯己定组和双氧水组P<0.01,次氯酸钠组和对照组生理盐水组P<0.05(见表1)。

表1 3种根管冲洗液对MMP-9水平的影响

(2) 3种根管冲洗液对MMP-8水平的影响 统计结果显示不同根管冲洗液对MMP-8具有影响。数据显示治疗后4组MMP-8水平均较治疗前低,其中氯己定组和双氧水组治疗前后差异有统计学意义(P<0.01),其余3组差异无显著性(见表2)。

表2 3种根管冲洗液对MMP-8水平的影响

(3) 3种根管冲洗液对MMP-2水平的影响 统计结果显示不同根管冲洗液对MMP-2水平具有影响。数据表明氯己定组治疗后MMP-2水平降低,差异有显著性(P<0.01),其余3组数据差异无统计学意义(见表3)。

3 讨论

(1) MMPs和牙髓炎的关系 在牙髓炎的发展过程中,MMP家族蛋白在炎症的进展中扮演双重角色,既能激发机体的免疫反应参与防护,也能引起组织的破坏。有研究显示,细菌及其内毒素能引起牙髓组织感染,刺激中性粒细胞脱颗粒,释放炎症因子,从而诱导MMPs的活化。Accorsi-Mendonça T等采用明胶酶谱法和ELISA,检测正常牙髓组织和炎症牙髓组织中MMP-9,MMP-2,TIMP-2,MPO的浓度和活性,发现炎症牙髓组织中MMP-9,MMP-2,TIMP-2和MPO的水平均有上升,且只有炎症组织中能检测到活化MMPs[9]。另外,在牙髓的脓肿组织和根管渗出液中,能发现高水平的MMP-8表达。而根管治疗治疗能降低MMP-8的表达[10]。实验中,4组患牙根管治疗后MMP-9、MMP-8、MMP-2的水平均有不同程度下降,证明根管冲洗对MMP-9、MMP-8、MMP-2有明显的抑制作用。

表3 3种根管冲洗液对MMP-2水平的影响Table 3 Effect of three kinds of root canal rinse solutions on the level of MMP-2

由于MMPs与牙髓炎的密切关系,有学者认为MMPs可能成为牙髓炎的标准性生化指标,用于辅助牙髓炎的临床诊断。牙髓炎的转归首选是牙髓复合体的修复和再生,否则,就是慢性炎症持续存在或牙髓坏死发生。评价牙髓炎的严重程度,是预测临床治疗成功与否的必要条件。单纯依靠临床症状的评估方法,其局限性是显而易见的。分子水平的检测方法,可以成为临床鉴别可逆与不可逆牙髓炎的辅助工具,提高保髓治疗的成功率。Zanini等[11]对32篇相关文献进行分析,综述了炎性介质在临床诊断中的作用,认为量化的炎症介质有助于临床区别可逆与不可逆牙髓炎。并认为IL-8和MMP-9的水平能够表明中性粒细胞在牙髓组织中的水平,有可能成为牙髓炎症的标志性因子。

实验结果显示MMP-9在牙髓炎根管渗出液的浓度明显高于MMP-2,MM-8,表明MMP-9可能与牙髓炎症的发生发展更加密切。

(2) 不同根管冲洗液对MMPs的影响 实验结果显示,MMP-9、MMP-8、MMP-2在牙髓炎症中均有表达,其中MMP-9浓度最高。1%次氯酸钠、2%氯己定、3%双氧水、0.9%生理盐水4种根管冲洗液均能使MMPs水平降低,其中2%氯己定能显著降低MMP-9、MMP-8、MMP-2的浓度。1%次氯酸钠能显著降低MMP-9的水平,双氧水能显著降低MMP-9和MMP-8的浓度。4组冲洗液中,氯己定对基质金属蛋白酶的抑制作用更加有效。

(3) 氯己定在牙体牙髓疾病治疗中的作用 氯己定是一种双胍类抗菌药物,它含有对称的2个 4-氯苯环和双胍基团,中间由环己烷桥连结。常用的氯己定制剂有:葡萄糖酸氯己定、醋酸氯己定和盐酸氯己定3种[12]。

氯己定是目前研究最多的非特异性MMPs抑制剂,Gendron等[13]首次研究发现氯己定有抑制 MMP-2、MMP-8、MMP-9 的作用,并认为氯己定会成为新型的抗菌剂。目前氯己定是常用的口腔抗菌药物,它能降低菌斑数量,减少牙龈出血,由于氯己定作用安全,副作用小,常添加于漱口水,用于牙周炎症治疗,也常用于窝洞消毒及根管冲洗。

氯己定抑制MMPs的机制可能是氯己定通过螯合作用结合钙、锌离子,从而抑制MMPs催化区域的活性[14]。氯己定的有效体积分数为0.002%～4%,最常用的体积分数是0.2%和2%。有研究显示,氯己定能够抑制牙本质来源的半胱氨酸组织蛋白酶的蛋白水解活性,说明氯己定是牙本质牙髓复合体中半胱氨酸组织蛋白水解酶的抑制剂,还可能通过抑制半胱氨酸组织蛋白酶的作用参与炎症的控制[15]。

近年的研究发现,MMPs不仅与牙髓的炎症有关,还与牙本质粘结修复密切相关,根管冲洗液对树脂粘结的影响也得到关注。Mohammadi等[16]综述了1980—2016年间的相关文献,评价了根管冲洗液对牙本质粘结的影响,包括常用的根管冲洗液次氯酸钠、氯己定、乙二胺四乙酸、四环素、酸和清洁剂的混合物、臭氧。结果显示,次氯酸钠可能降低、加强或者对粘结强度无作用。氯己定、酸和清洁剂的混合物能显著提高树脂-牙本质粘结的稳定性,而臭氧治疗对粘结强度的作用尚有争议。

氯己定作为MMPs的非特异性抑制剂,能够和MMPs竞争结合阳离子形成金属螯合物,从而抑制MMPs的活性,在牙本质粘结过程中,达到减缓胶原纤维降解,稳定混合层,增加粘结效果,提高粘结耐久性的目的。实验也证明氯己定具有抑制MMP-9、MMP-8、MMP-2的作用。对于根管冲洗液的作用和选择,需要综合考虑到治疗的各个步骤中。实验发现,临床常用的3类根管冲洗液均具有降低MMPs的作用,其中氯己定有最显著抑制MMPs的效果。氯己定能够有效的抑制牙髓炎症组织中的MMPs,又可以增加牙本质粘结强度,是牙体牙髓病治疗与修复较好的治疗选择。