新型冠状病毒猕猴感染实验生物安全管理

孟轲音，万忠海，李吉平，卜昭阳，缪发明，姚腾，高玉伟，刘军

军事医学研究院 军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122

新型冠状病毒病（COVID-19）是继2003年SARS、2004年禽流感、2014年埃博拉疫情以来的又一起国际公共卫生事件，目前全球感染人数不断攀升，国际疫情仍未得到有效控制，人类生命健康受到严重威胁，也给社会经济造成重大损失。故此，相关机构陆续开展了新型冠状病毒检测、疫苗研制、防治药物筛选及致病机制研究工作。我国卫健委按其危害程度，将SARS-CoV-2归为二类病原微生物进行管理，规定动物感染实验应当在动物生物安全三级实验室操作[1]。本文结合生物安全实验室管理相关法律法规及实际工作经验，以SARS-CoV-2感染猕猴为例，对风险评估、实验室类型及关键防护设备、人员培训、个体防护装备、人员进出流程、猕猴转运、猕猴实验操作、消毒灭菌、意外事故处理等关键环节的生物安全有关事项进行阐述。

1 新型冠状病毒感染猕猴实验风险评估

1.1 风险评估时机及方式

在开展新冠病毒猕猴感染实验前，应进行相关实验活动风险评估，识别风险因素，建立风险控制措施，评估风险级别。

本实验的风险评估由实验人员与生物安全管理人员共同完成。实验人员主要侧重生物因子和实验活动的风险分析，生物安全管理团队依据生物因子特性及拟开展的实验活动负责设施设备、个体防护装备、人员进出、消毒灭菌、意外事故等的风险分析。

1.2 风险评估侧重点

SARS-CoV-2可感染人和其他哺乳动物，除经飞沫和密切接触传播外，也有通过气溶胶、粪-口及眼结膜多种途径传播的可能。其传染性强、传播速度快[2]，加之本次实验动物为猕猴，较对鼠的生物安全管理复杂很多。因此，我们在充分考虑此病原特性及实验动物特点的基础上，着重在动物饲养操作笼具的设计、个体防护装备的选用、动物逃逸风险的分析方面进行反复研讨，多次论证。

2 实验室类型及关键防护设备

2.1 实验室类型

根据实验室设施条件和动物饲养设备不同，ABSL-3分为不同类型，具备开展新冠病毒猕猴感染实验的ABSL-3实验室包括《实验室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）规定的4.4.2和4.4.3类实验室，主要区别是是否可有效利用安全隔离装置（如生物安全柜、手套箱式隔离器）操作常规量经空气传播致病性生物因子。目前在生物安全实验室使用的猴饲养隔离器主要有2类，一类是半开放式隔离器，另一类是全封闭的手套箱式隔离器。如果采用前者饲养动物，须在4.4.3类实验室工作；如果采用后者饲养动物，则在4.4.2类实验室即可。本实验室采用手套箱式负压隔离器，隔离器符合《实验室设备生物安全性能评价技术规范》（RB/T 199-2015）的要求，因此使用4.4.2类实验室开展猕猴感染实验。

2.2 关键防护设备

开展本实验涉及的关键防护设备，如生物安全柜、双扉高压灭菌器、过氧化氢发生器均为标准化设备，而猕猴负压隔离装置目前缺乏像鼠IVC笼具一样的标准化设备。依据猕猴智力发达、攻击性强、喜抓咬等特点，为了确保猕猴饲养和实验操作的安全性，我们从以下几方面考虑，设计制作了手套箱式猕猴负压隔离器：①负压隔离器在气密性及相对压差应符合《实验室设备生物安全性能评价技术规范》（RB/T 199-2015）的要求；②负压隔离器上应装有传递窗，以便猕猴及物品的相互传递；③负压隔离器上应安装猕猴保定用人工推拉式拉杆，以尽可能避免实验过程中猕猴对人员造成伤害；④负压隔离器上应装有备用风机，以避免负压隔离器故障带来生物安全风险；⑤负压隔离器上应装有锁具。

3 培训考核

拟进本实验室开展工作的实验人员，均须经过实验室培训并考核合格。

3.1 人员培训

本实验室将人员培训分为4个等级。一级主要为生物安全通用环节培训，包括生物安全基本知识、人员进出流程、个体防护装备穿脱、废弃物处理、高压灭菌、实验室日常清理及消毒、设施设备操作等；二级在一级培训的基础上增加了细胞实验生物安全操作；三级在二级培训内容的基础上增加小鼠实验生物安全操作；四级在以上三级培训内容外，根据工作实际需要增加了大中动物（如猴、貂、狗、猫、猪等）生物安全操作。

3.2 人员考核

实验人员经过培训后均须接受专家组的考核，考核合格后可获得实验室相应等级证书，并且实验室为每一名实验人员单独建立了人员技术档案和培训档案。获得一级证书的人员可作为实验实习员进入实验室，不得独立开展实验；获得二级及以上证书的人员为实验正式人员，可根据等级证书培训范围开展相应实验。

获得四级证书的人员方可开展SARS-CoV-2感染猕猴实验。且由于新冠病毒是一种新的病毒，对其了解不充分，因此开展相关动物实验可能会遇到新的问题。本实验室在实验开始前和实验过程中，除了开展常规的生物安全培训外，还多次组织实验室管理人员和项目人员集中学习研讨，及时发现并解决实验过程中存在的问题，改进优化标准操作规程（SOP），建立了非常良好的工作交流机制，为开展新冠病毒猕猴感染实验提供了人员技术保障。

4 个体防护装备

4.1 个体防护装备的选用

在ABSL-3实验室开展实验时，通常个体防护装备选用双层防护服配双层鞋套，其中内层为棉质面料，外层为一次性防护面料，另外还须佩戴双层手套、护目镜和N95口罩。

在SARS-CoV-2感染猕猴实验中，由于SARS-CoV-2传染性极强、传播速度极快等特点，建议面部防护选用正压头罩内戴N95口罩替代护目镜。对猕猴进行麻醉、免疫、攻毒、采样、解剖实验时，还应根据具体情况佩戴防抓咬手套和防割伤手套，用X线对猕猴进行影像检查时还应穿戴防辐射隔离衣。另外，用双扉高压灭菌器进行实验废弃物消毒灭菌时还应佩戴防烫伤手套。

4.2 选用时注意事项

应根据个人身材特点选择合适尺码的防护服，以增加实验操作的舒适性，减少暴露风险。一次性防护服标准应符合欧标EN14126，如需无菌操作，还应符合GB 19082-2012[3-4]。

双层手套建议选用内深外浅的乳胶或丁腈手套，以便在手套破损时容易识别。实验过程中如外层手套被污染，应及时更换。

5 人员进出流程

5.1 一般流程

实验室人员应遵循洁净区、半污染区、污染区的进入原则，退出应遵循污染区、半污染区、洁净区的退出原则。通常将更换洁净衣物的更衣室划为洁净区，更换防护服的更衣室、缓冲间和缓冲走廊划为半污染区、核心间划为污染区[5]。

5.2 特殊流程

在SARS-CoV-2感染猕猴实验中，实验人员往往在动物实验后还要进行细胞实验，须从一个核心区转移到另一个核心区。转移过程中，实验人员应在与核心间相邻的缓冲间脱掉外层防护服，在缓冲走廊换上预先准备好的一次性防护服，既而进入下一个核心间。

6 猕猴转运

6.1 转运包装物的选择

猕猴转运时最好选用一次性包装物，通常采用特制的转运笼或双层生物安全包装。转运包装物不得随意带出，必须经双扉高压灭菌器高压后方可转出实验室。

6.2 转运路线

在用猕猴开展SARS-CoV-2研究工作时，须将待养在观察区的猕猴转运至ABSL-3实验室核心区负压笼具内。根据猕猴体型特点，一般可从传递窗传入。由于猕猴动作敏捷、攻击力较强，故传入前应先将猕猴麻醉，后经辅助区传递窗传至缓冲走廊，再经缓冲走廊传递窗传至核心区。

6.3 转运方法

6.3.1 转运人员布局 猕猴转运时应在辅助区、缓冲走廊、核心间即洁净区、半污染区、污染区分别布设人员，人员不可逆行，待动物转运完毕后，洁净区、半污染区人员方可按流程进入核心区。

6.3.2 传递窗的使用 用预先准备的75%酒精喷洒传递窗周围，以阻断传递窗内可能溢出的病毒粒子，然后打开传递窗，将带有外包装的已麻醉的猕猴放入传递窗后关闭传递窗，接着打开另外一侧传递窗，开启前仍须用75%酒精喷洒传递窗周围，开启后用75%酒精喷洒传递窗内部，待取出猕猴后关闭传递窗，同时开启紫外灯照射半小时，再传递下一批实验动物。

7 猕猴实验操作

7.1 实验内容

在动物生物安全三级实验室进行操作的新型冠状病毒猕猴实验一般包括猕猴麻醉、病毒接种、采血及分离血清、体温测量、鼻咽肛拭子采样、病理解剖等。

7.2 注意事项

①实验操作须2～3名人员进行；②实验操作均须在猕猴麻醉状态下进行；③猕猴麻醉应在负压动物饲养箱中进行；④实验操作过程中始终要观察猕猴是否有苏醒迹象，如有苏醒迹象则对猕猴进行追加麻醉；⑤麻醉用注射器应装入盛有消毒剂的锐器盒内消毒，而后装入双层生物安全包装袋内双扉高压处理；⑥采血收集管应为螺口离心管，将血液从注射器推入时，管口应有酒精棉球覆盖；⑦进行猕猴气管内接种病毒，注射器在注入及拔出时均须通过酒精棉球；⑧注射器针头的夹取均须用止血钳；⑨猕猴尸体的解剖须将尸体按转运规程运至负压解剖箱中进行；⑩实验用过的耗材均须放在双层高压灭菌袋内或放入盛有消毒液的高压灭菌桶内浸泡后双扉高压处理。

8 消毒灭菌

根据国家卫健委COVID-19相关指南，酒精、含氯消毒剂、二氧化氯、过氧化氢、过氧乙酸对SARS-CoV-2有较好的杀灭作用，而氯己定对SARS-CoV-2 无效[6-7]。

综合卫健委指南、同行推荐及本实验室消毒剂效果验证，从消毒剂的消毒效果、对物品的腐蚀性、对人体的危害程度等多方考量，建议正压头罩和主机外表面选用75%酒精喷洒消毒，外层防护服及实验室日常消毒选用1%卫可喷洒消毒，生物安全柜日常消毒选用75%酒精喷洒擦拭消毒，需要浸泡消毒的物品采用75%酒精浸泡消毒，如有被血渍污染的的器械可先用新洁尔灭浸泡去污渍，猕猴尸体及其他废弃物均须双层包装、表面消毒后双扉高压处理，实验室终末消毒采用过氧化氢汽化消毒。

9 意外事故处理

实验室意外事故有多种类型，本实验室针对人员意外伤害、感染性物质溅洒、仪器设备故障、动物逃逸、火灾及自然灾害等意外事故，均制备了完善的意外事故处置预案。下面仅就与此实验特性相关的意外事故处理加以简单描述。

9.1 猕猴抓咬伤

猕猴天性好动、抓咬能力强，在实验过程中一定要避免此类现象的发生。如意外发生猕猴抓咬伤，应立即停止工作，在同事配合下按程序消毒伤口退出实验室，到医学观察室隔离观察，观察自觉症状，定期检测核酸。如怀疑有感染症状，应立即到定点医院就医，如无自觉症状，定期核酸检测均为阴性，2周后可解除隔离。同时，报告生物安全负责人，填写《意外事故处理记录》。

9.2 猕猴逃逸

因为猕猴处于清醒状态时始终被锁于负压隔离器内，故发生逃逸的可能性极小。ABSL-3实验室门处于互锁状态，即使猕猴发生逃逸，也不会逃出实验室。但为了避免意外发生，实验室内应备有专业麻醉枪，一旦发生猕猴逃逸，可利用麻醉枪对其抓捕。

面对国际频发的公共卫生事件、日趋复杂的生物安全问题，我国大力加强高等级生物安全实验室建设力度，有效提高了突发疫情的应对能力和处置能力，但仍须在更高层次统筹生物安全管理，总结国内外管理方法的差距，健全国家生物安全管理体系，建立国产化防护装备和产品的各类标准。