GnRH激动剂长方案中不同促排卵药物对卵巢慢反应分娩结局的影响

唐小饰，温灿鑫，潘 萍，李 予

（1.北京市航天总医院妇产科，北京 100076；2.中山大学孙逸仙纪念医院妇产科生殖中心，广东 广州 510120）

促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）方案是体外受精或卵胞浆内单精子注射-胚胎移植（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI-ET）治疗中常用且结局良好的促排卵方案之一，但有部分卵巢储备正常患者在该方案中发生卵泡发育的慢反应，导致周期取消率增加和妊娠率下降等不良结局。研究显示在GnRH激动剂方案促排卵发生卵巢慢反应时，添加含黄体生成素（luteinizing hormone，LH）活性的药物对临床结局的改善作用优于增加卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）剂量［1-2］。添加含LH活性的不同药物，包括人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、人重组黄体生成素（recombinant luteinizing hormone，rLH）及人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotro⁃pin，HMG），目前对这几种不同药物改善卵巢慢反应的效果无大样本的临床研究。因此，本研究拟探讨卵巢储备功能正常患者采用GnRH激动剂方案促排卵时发生卵巢慢反应，补充含LH活性的不同药物对IVF结局的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2014年1月1日至2016年6月30日在本中心行IVF/ICSI-ET助孕的不孕患者，共纳入872例进行回顾性分析。纳入标准：①年龄＜40岁；②双侧卵巢同时存在，窦卵泡数（antral follicle count，AFC）＞7个；③第1或2 IVF周期；④GnRH激动剂方案（包括长效长方案、短效长方案、超长方案），促性腺激素（gonadotropin，Gn）启动量≥150 U/d；⑤慢反应的判断标准［3］：Gn刺激卵巢5～8 d时，无卵泡＞10 mm且雌二醇（estradiol，E2）＜660 pmol/L；⑥促排卵中后期添加hCG、rLH或HMG。排除标准：既往无卵巢低反应史。本研究获得中山大学孙逸仙纪念医院生殖伦理委员会批准，并取得患者知情同意。

1.2 促排卵方案与分组

1.2.1 长方案 于黄体中期单次肌肉注射0.93 mg或1.25 mg长效GnRH激动剂（曲普瑞林，法国益普生或德国辉凌），或于黄体中期每天皮下注射0.1 mg短效GnRH激动剂（曲普瑞林，法国益普生或德国辉凌公司），14 d后检测外周血FSH、LH、E2、孕激素（progesterone，P），并通过经阴道B超计数双侧卵巢卵泡数、卵泡径线、卵巢容积及内膜情况。符合降调标准者（FSH＜5 U/L，LH＜5 U/L，E2＜185 pmol/L）予外源性Gn≥150 U/d启动促排卵。Gn包括重组卵泡刺激素α（recombinantfolli⁃cle-stimulating hormone，rFSH-α）（果纳芬，德国默克雪兰诺公司）、尿促卵泡素（丽申宝，中国丽珠医药有限公司）或rFSH-β（普丽康，德国默沙东公司）。

1.2.2 超长方案 于月经第2天开始注射GnRH激动剂（1.87～3.75 mg），末次GnRH激动剂注射3～4周后予外源性Gn≥150 U/d启动促排卵。

1.2.3 分组促排卵第5～8天无卵泡直径＞10 mm且E2＜660 pmol/L，补充含LH活性的药物，分别为小剂量hCG（中国丽珠医药有限公司）100 U/d、rLH（乐芮，德国默克雪兰诺公司）75～150 U/d或HMG（贺美奇，德国辉凌公司）75～150 U/d。根据补充LH活性的药物不同分为hCG组（n=28）、rLH组（n=319）及HMG组（n=525）。其中hCG组包含曾用过HMG或rLH效果不明显者15例，占hCG组53.6%。以HMG组为对照组，比较hCG组及rLH组与HMG组之间的实验室参数及临床结局。

1.3 扳机、取卵、体外受精与胚胎移植和黄体支持

当有2个卵泡直径超过18 mm或3个直径超过17 mm时注射hCG（人绒毛膜促性腺激素，中国丽珠医药有限公司）6 000～10 000 U或重组人绒促性素（艾泽，德国默克雪兰诺公司）250 μg诱导卵子成熟。扳机后的36 h左右在经阴道超声的引导下行穿刺取卵术，穿刺所有直径超过10 mm的卵泡。根据处理后的精液情况，决定行IVF/ICSI受精，胚胎按照常规培养3 d。依据Istanbul共识胚胎评分标准行胚胎评分［4］。于取卵后72 h，择优进行胚胎移植。根据不孕患者的年龄、是否为疤痕子宫及取卵数目等情况决定具体胚胎移植数目，余可利用胚胎玻璃化冷冻技术予以冷冻保存。取卵日开始给予每日肌肉注射黄体酮60 mg或阴道用微粒化黄体酮胶囊（安琪坦，比利时博赏公司）600 mg或黄体酮阴道缓释凝胶（雪诺酮，德国默克雪兰诺公司）90 mg。移植2周后测血β-hCG，若血β-hCG＞25 U/mL，为妊娠试验阳性。移植后4～5周行经阴道B超检查，若宫内可见孕囊者诊断为临床妊娠，并随访妊娠结局。

1.4 观察指标

主要观察指标为活产率；次要观察指标为Gn使用量和使用天数及促排卵中性激素变化情况、获卵数、2PN数、2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、冷冻胚胎数、移植胚胎数、种植率、临床妊娠率、流产率、多胎妊娠率。其中活产率为活产周期数/移植周期数。2PN受精率为2PN受精数/获卵数；卵裂率为卵裂胚胎总数/（2PN+0PN+多PN受精数）；可利用胚胎率为可利用胚胎数/卵裂胚胎总数；种植率为宫腔内孕囊总数/移植胚胎总数；临床妊娠率为临床妊娠周期数/移植周期数；流产率为流产周期数/临床妊娠周期数；多胎妊娠率为多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，连续变量资料中正态分布变量以均数±标准差（）表示，非正态分布变量以四分位数［M（P25～P75）］表示，定性资料用率（%）表示；3组间均数比较，若满足独立、正态、方差齐性，采用单因素方差分析，若3组间差异有统计学意义，则采用LSD法进行两两比较；若不满足则采用非参数检验Kruskal-WallisH检验，若3三组间差异有统计学意义，则采用Nemenyi法进行两两比较。3组间率的比较采用Chi-square检验，若3组间差异有统计学意义，则采用卡方分割进行两两比较。两两比较结果以HMG组为对照显示。双侧检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的基本资料

3组患者之间的年龄、不孕年限、不孕因素、体质量指数（body mass index，BMI）、基础FSH及窦卵泡数等差异均无统计学意义（P＞0.05）。3组之间基础LH的差异有统计意义（Hc=8.520，P=0.014），经两两比较发现，hCG组的基础LH高于HMG组，差异有统计学意义［（5.14.2～7.6）vs.4.3（3.2～5.8）U/L，P=0.043；表1］。

2.2 促排卵情况

3组之间促排卵方案的差异有统计学意义（χ2=13.485，P=0.001），经两两比较发现，hCG组采用超长方案促排卵比例高于HMG组，差异有统计学意义（14.3%vs.1.1%，P＜0.001）。3组之间Gn使用天数及使用总量的差异均有统计学意义（Hc=19.382，P＜0.001；Hc=18.015，P＜0.001），经两两比较发现，hCG组Gn使用天数及使用总量多于HMG组，差异有统计学意义［15.0（13.0～16.8）vs.13.0（12.0～15.0）d，P=0.027；2 925（2 531～3900）vs.2550（2100～3225）U，P=0.046］；rLH组Gn使用天数及使用总量低于HMG组，差异有统计学意义［13.0（12.0～14.0）vs.13.0（12.0～15.0）天，P=0.009；2 400（1 950～3 075）vs.2 550（2 100～3 225）U，P=0.009］。3组之间在促排卵第5～7天FSH水平、E2水平及扳机日FSH水平、LH水平的差异均有统计学意义（Hc=18.044，P＜0.001；Hc=26.584，P＜0.001；Hc=42.405，P＜0.001；Hc=43.098，P＜0.001），经两两比较发现，hCG组在促排卵第5～7天的E2水平明显低于HMG组，差异有统计学意义［50.0（24.0～76.0）vs.87.0（53.0～149.0）ng/L，P＜0.001］；rLH组在促排卵第5～7天及扳机日FSH水平低于HMG组，扳机日LH水平高于HMG组，差异均有统计学意义［14.4（11.3～18.4）vs.16.3（12.6～20.6）U/L，P＜0.001；16.5（12.2～20.7）vs.19.3（15.2～24.7）U/L，P＜0.001；1.6（1.2～2.2）vs.1.3（0.9～1.8）U/L，P=0.001］。余无统计学意义（P＞0.05；表2）。

表1 三组患者的基本资料比较Table 1 Baseline data of patients in three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

表1 三组患者的基本资料比较Table 1 Baseline data of patients in three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

BMI：body mass index；FSH：follicle-stimulating hormone；E2：estradiol；LH：luteinizing hormone；AFC：antral follicle count；1）hCG HCG group compared groupcompared to HMG group，P＜0.05；2）statistically significant.

2.3 实验室相关参数比较

3组之间的获卵数、2PN数的差异均有统计学意义（Hc=8.422，P=0.015；F=3.697，P=0.025），经两两比较发现，hCG组的获卵数、2PN数低于HMG组，差异有统计学意义［8.0（6.3～11.0）vs.11.0（7.5～16.0），P=0.015；（5.4±3.2）vs.（7.7±4.4），P=0.007］。3组之间的2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、冷冻胚胎数及移植胚胎数等差异无统计学意义（P＞0.05；表3）。

2.4 临床结局相关参数比较

3组之间的种植率、临床妊娠率、多胎妊娠率、活产率、流产率、异位妊娠率相当，差异均无统计学意义（P＞0.05；表4）

3 讨论

GnRH激动剂方案仍然是目前临床广泛应用于IVF助孕的促排卵方案，垂体降调节后行卵巢刺激可表现为正常反应、低反应和慢反应，慢反应的判断标准于2011年在业界达成共识，即卵巢储备功能正常以及正常促性腺激素水平的不孕症患者，使用GnRH激动剂长方案，在促排卵过程中发生以下情况：FSH刺激卵巢6～8 d，无＞10 mm卵泡，E2＜180 pg/mL；卵泡生长减慢，从每天增长1～2 mm减至3 d内增大小于2 mm。卵巢慢反应可能导致周期取消率增加、获卵数减少、胚胎种植率和临床妊娠率降低等不良结局［1-2］。卵巢慢反应的发生机制尚不明确，目前主要考虑以下两个方面的影响因素。一方面，降调节使得垂体抑制过深从而导致内源性LH相对或绝对不足，这考虑为卵巢慢反应的主要原因［5-6］。GnRH激动剂的剂型、剂量及给药途径等对降调节的深度存在一定影响，有可能导致卵巢慢反应［5］。另一方面，有研究表明LH编码区的多态性与LH活性的降低有关，降调节后LH进一步被抑制，从而不足以维持多卵泡发育，导致慢反应的发生。如常见的突变种类LH-β（variant 8Arg-15Thr）已报道与慢反应相关［7-8］。研究显示，单次全量GnRH-a（3.75 mg）对垂体产生过深的抑制作用致LH分泌相对不足，与半剂量GnRH-a（1.87 mg）相比，其获卵总数、受精卵子总数以及优质胚胎数等都明显减少，虽然种植率、妊娠率和流产率与半剂量组可达到相当水平，但是累计妊娠率明显低于半剂量组［6］。我们在2012年的研究显示三分之一剂量GnRH-a（1.25 mg）降调节与半剂量相比均无早发LH峰出现，但降调节后LH＜1.0 U/L的比例明显降低、优质胚胎率显著增加，活产率呈增高的趋势（42%vs.32%）［9］，并且长效GnRH-a的使用剂量与促排卵过程的LH呈负相关［10］。即GnRH-a适宜的使用剂量，避免垂体过度抑制有利于改善临床结局。

表2 三组的促排卵情况Table 2 Stimulation characteristic in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

表2 三组的促排卵情况Table 2 Stimulation characteristic in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

COH：controlled ovarian hyperstimulation；GnRH-a：gonadotropin releasing hormone agonist；Gn：gonadotropin；FSH：follicle-stimulating hormone；E2：estradiol；LH：luteinizing hormone；P：progesterone；1）statistically significant；2）hCG group compared to HMG group，P＜0.05；3）rLH group compared to HMG group，P＜0.05.

表3 三组间的实验室相关参数比较Table 3 Laboratory variables in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

表3 三组间的实验室相关参数比较Table 3 Laboratory variables in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

1）statistically significant；2）compared to HMG group，P＜0.05

表4 三组间的临床结局相关参数比较Table 4 Clinical variables in the three groups［n（%）］

GnRH激动剂方案中发生卵巢慢反应时常用的对策是适当增加FSH剂量或者添加含LH活性的制剂，研究显示均可改善卵巢反应，增加获卵数［11］。但是，国内外均有研究显示发生卵巢慢反应时补充rLH的种植率和妊娠率高于增加FSH剂量［12-13］。但添加含LH活性的不同药物对临床结局的改善作用的疗效比较缺乏大样本的研究。因此，本研究针对卵巢慢反应添加含LH活性的不同药物包括HMG、rLH及hCG，比较三者临床结局的差异。

以添加HMG作为对照，rLH组Gn的使用天数及总量较HMG组偏少。Ferraretti等［14］的研究结果显示卵巢反应不良者添加rLH或HMG组所使用Gn天数以及总量无明显差异，而rLH组的种植率及妊娠率明显高于HMG组。Dahan等［15］的研究显示在窦卵泡数大于6个的卵巢慢反应患者，促排卵过程中添加rLH的妊娠结局高于添加HMG。而在本研究中卵巢储备正常患者发生卵巢慢反应时，添加rLH组与添加HMG组的2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、种植率、妊娠率、活产率无明显差异。有研究显示FSH联合rLH与联合HMG相比，促排卵过程中血清及卵泡液的激素水平相似，表明两者促进卵泡发育与激素代谢的活性相当［16］。hCG组促排卵5 d后的雌二醇水平明显低于rLH组和HMG组，显示了该组尽管基础LH正常且较其他组高，但由于超长方案的比例高，垂体抑制更为显著，导致慢反应卵泡发育缓慢和雌激素的表现更为明显；hCG组Gn的使用天数及总量较HMG组更多，考虑可能与慢反应程度更深，需要更长的促排时间有关；hCG组的获卵数、2PN数较HMG组少，但是hCG组的2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、种植率、妊娠率、活产率均能达到与HMG组相似的水平。hCG在结构上与LH相似，生物学活性也与LH接近，并且半衰期更长，与受体结合的亲和力较高，生物学活性更强［17］，故适当添加hCG可以补充LH活性［18］。Filicori等［19］的研究表明，在不孕患者GnRH激动剂方案促排卵的后期添加小剂量hCG可以减少促排卵时FSH或HMG的使用量，并且不会导致过早黄素化，同时能达到促进卵泡发育的效果，获得与单纯添加rLH或HMG组相似的获卵数、种植率及临床妊娠率。本研究针对发生卵巢慢反应的患者，结果也显示添加小剂量hCG与添加HMG的临床结局相似。添加hCG组获卵数、2PN数明显少于添加HMG组，考虑hCG在促排卵中、后期阶段有减少排卵前的小卵泡数的作用［19］；并且本研究中hCG组采用超长方案的比例明显高于HMG组，不排除因降调节抑制过深导致获卵数、2PN数偏少的可能。此外值得注意的是，添加hCG组中53.6%为前期添加HMG或rLH后卵巢慢反应表现未得到改善而改用hCG，最终临床结局仍可得到改善。这表明hCG在添加HMG或rLH后效果不明显者仍可获得相当的效果。促排卵中、后期添加hCG可刺激卵泡生长和成熟，促进成熟卵泡发育［20］。

综上所述，本研究表明卵巢储备功能正常的患者在GnRH激动剂方案中发生卵巢慢反应时，添加含LH活性的不同制剂均可改善卵巢反应，获得相似的临床结局。在HMG或rLH添加后效果改善不明显者，小剂量hCG的添加仍可获得相当的效果。