基于高通量测序技术对野生和圈养华北豹肠道真菌多样性的分析

华 彦 郎鹏飞 王洪堂 王 姣 曹和琴 姜广顺*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.广东省林业科学研究院，广州，510520)

华北豹(Pantherapardusjaponensis)是中国特有的豹亚种，曾广布于中国的华北地区，由于栖息地丧失和过度捕猎等因素，近年来，华北豹的分布急剧退缩，现仅分布于中国的山西、河南、河北等省份[1]，在动物园饲养有少量野外救护个体。胃肠道慢性炎症[2-4]等病症与肠道微生态紊乱有关，尤其是对区域性的极小种群而言，动物的肠道疾病可能成为物种受胁的潜在重要因素。肠道微生物主要由细菌和少量真菌及其他微生物组成[5]，真菌虽然占肠道微生物比例低，但其群落结构与物种、食性、疾病等因素密切相关[6]。近年来，肠道微生物中真菌的研究越来越受关注，Albenberg等[7]曾报道了炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)肠道微生物群中真菌特征，发现患病样本中特异性念珠菌分类群的丰富度有明显的增加，肠道真菌紊乱是导致IBD发生、发展的重要因素[8]。抗生素是兽医常用的药物，研究表明长期使用抗生素会导致肠道菌群失衡，具有保护作用的细菌减少，真菌数量增加，从而导致腹泻[9]。Li等[10]发现腹泻牦牛(Bosgrunniens)肠道新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)显著高于健康牦牛，新丽鞭毛菌门丰度过高可能是导致腹泻的主要原因。

因肠道菌群失调造成其微生态失衡而引起一系列肠道疾病是人工圈养濒危野生动物主要原因之一。彭智伟[11]对野生东北虎(Pantheratigrisaltaica)、东北豹(Pantherapardusorientalis)等大型猫科(Felidae)动物肠道微生物中的细菌群落进行了分析，但对肠道真菌的研究显见报到。本研究通过高通量测序技术对圈养和野生华北豹粪便中真菌类型进行研究，以探究华北豹肠道真菌多样性和优势菌群，比较人工圈养与野生两种条件下华北豹肠道真菌菌群的差异，为华北豹的迁地保护提供科学管理的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在山西铁桥山省级自然保护区采集24份野生华北豹新鲜粪便样品，在山西太原动物园和河南森林公园采集野外救助的人工圈养华北豹粪便样品7份。每份样品记录了采集地坐标及日期等信息，装于样品袋中，-80 ℃保存。

1.2 华北豹肠道真菌DNA提取

真菌胞壁比原核生物要厚10倍左右，所以先将样本在超低温冰箱和37 ℃水浴锅中反复冻融5次，以提高真菌DNA的提取效果。通过E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒进行粪便样品总DNA的提取。

1.3 华北豹肠道真菌18S rRNA的PCR扩增

利用引物547F(5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3′)，引物V4R(5′-ACTTT-CGTTCTTGATYRA-3′)靶向18S SSU rRNA基因的V4区[12]。PCR混合物包含16 μL高压灭菌蒸馏水，10 μL PCR Buffer(5x)，4 μL dNTPs(2.5 mM)，10 μL GC Buffer(5x)，5.5 μL DNA模板，0.5 μLTaqE，正向和反向引物(工作浓度：10 μM)各2 μL，每个反应总体积为50 μL。35个PCR循环包括在98 ℃下持续25 s，55 ℃持续30 s和72 ℃持续50 s，在此之前在98 ℃下持续5 min的预变性，并在35个PCR循环后以72 ℃持续7 min后结束整个反应。在Gold-View染色的2%琼脂糖凝胶上电泳后分析PCR产物。

1.4 18S rRNA的文库制备和Miseq测序

采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，之后进行文库质检与定量，对合格的文库，在MiSeq机器上利用Mi Seq Reagent Kit V3(600个循环)进行 2×300 bp 的双端测序。通过对双端序列数据的数据过滤和双末端拼接操作，得到有效数据，再利用 FLASH 软件将有效 reads 拼接组装成一条序列。

为得到华北豹肠道中较好的真菌物种多样性信息，对获得的原始序列使用 QIIME 软件对测序数据进行优化处理。去除接头和无重复单序列，以便降低冗余计算量。以97%相似度，将所有样品优化后的序列聚类成为 OTU(operational taxonomic units)。

1.5 华北豹肠道真菌多样性的分析

基于OTU聚类结果，利用Mothur软件计算华北豹肠道真菌的Alpha多样性。Alpha多样性指数可用来对各样品的丰富度和多样性进行比较分析，常用的Alpha多样性指数包括Chao1指数、Shannon指数以及Simpson指数。Chao1指数表明样品中群落的丰富度，Shannon 指数呈现群落的多样性，而Simpson指数则是群落中优势种集中程度的体现。

利用 Mothur 软件做丰富度稀释性曲线及Shannon指数分析，作为测序数据量不同样本中物种丰富度比较的依据，也可作为样本测序量合理与否(是否足以覆盖所有类群)的评价标准，得出样本测序深度，同时反映华北豹肠道真菌多样性指数，显示华北豹肠道中绝大多数的真菌信息。

2 结果与分析

2.1 OTU数目与Alpha多样性指数分析

31份华北豹粪便样品原始序列共计1 352 804条，平均每份样本43 638.84条；质控后的序列共计1 209 271条，平均每份样本39 008.74条。样品质控后的序列读长主要位于300—390 bp，所有样品优化聚类后，共得到1 797个 OTU(图1)。

图1 测序序列质量控制前后读长分布Fig.1 The reading lengths of the sequences

本实验中的Chao1指数为3—218，表明各样品的丰富度不高。Shannon指数与Simpson指数的数值越大，则表示样品中物种的多样性越高，物种分布的均匀度越好。覆盖率的大小则反映了样品测序的深度，本实验31份样品的覆盖率均在99.23%以上，说明该实验测序结果能很好地反应样品中真菌的情况。

从图2与图3分别是野生与圈养华北豹样品中真菌的丰富度稀疏曲线和Shannon指数稀疏曲线，从图中可以看出当测序量达到3 000时，各样品的OTU数目增加基本趋向平缓，这说明更多的数据量只会产生少量OTU数目，这也表示该实验的测序数据量合理。从图中也可明显看出，野外与圈养华北豹所有样品Shannon曲线，均已经达到平缓的走势，这也反映了样品量较为合理。

表1 野生和圈养华北豹肠道真菌多样性指数

Tab.1 The diversity of Alpha in wild leopard and captive leopard

2.2 物种组成及优势菌群分析

2.2.1 门水平上肠道真菌菌群组成及丰富度

对24份野生华北豹粪便样品、7份圈养华北豹粪便样品在门水平和属水平上进行物种注释分析，可确定其肠道真菌菌群中的 6个菌门，无法鉴别菌群的序列这里统一归并为其他(unidentified)。其中子囊菌门(Ascomycota)在华北豹肠道真菌菌群中含量都是最高的，各样品的平均含量为61%、担子菌门(Basidiomycota)的平均含量为19%、毛霉门(Mucoromycota)的平均含量为9%、壶菌门(Chytridiomycota)的平均含量为3%、芽枝霉门(Blastocladiomycota)的平均含量为0.05%，以及未确定(unidentified)的平均含量为6%，Zoopagomycota菌门只在野生华北豹个体样品中检测到平均含量为2%。

2.2.2 野生和圈养华北豹肠道真菌群落比较

图5是野生和圈养华北豹这2组样品共有和特有 OTU 数目的 Venn 图。2组样品共有631个OTU，重叠部分表示2组共有的 OTU 数目为 97个，野外华北豹组(YW)特有的OTU为 519个，圈养华北豹组(JY)特有的 OTU 个数为14个。野外特有的真菌有柄孢壳菌属(Podospora)、念珠菌属(Candida)、Cystofilobasidium、隐球菌属(Cryptococcus)、Rhodosporidiobolus、隐囊菌属(Aphanoascus)、Saitozyma、横节霉菌属(Chalara)、Helicodendron、子囊壳菌属(Coniochaeta)；圈养特有的有复膜孢酵母菌属(Saccharomycopsis)、Cyniclomyces、Lodderomyces、Gamsiella、Diutina、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、孢圆酵母(Torulaspora)。

图2 丰富度稀疏曲线Fig.2 The richness rarefaction curve

图3 香农指数稀疏曲线Fig.3 The Shannon index rarefaction curve

图4 野生与圈养华北豹肠道真菌门水平下的组成结构Fig.4 The bar chart of fungal on phylum in wild leopard and captive leopard

图5 野生与圈养华北豹样本中独有及共享操作分类单元(OTU)Venn图及显示各属水平的比例饼形图Fig.5 Venn diagram showing unique and shared operational taxonomic units(OTUs)between wild leopard and captive leopard samples.A pie chart of the respective proportions of genus is shown

2.2.3 属水平上的物种丰度聚类热图

图6所示野生华北豹与圈养华北豹肠道真菌属水平上的丰度，选用丰度排名前50的属绘制的聚类分析热图，图中色块越靠近红色表示某份样品对应的某一物种比例越高，反之，色块越靠近绿色表示某份样品对应的某一物种比例越低。总体来看，野生华北豹组较圈养华北豹组的物种丰度有变化，说明野生华北豹较圈养华北豹组间的物种多样性存在差异。图中可见，样本19独自为一组，其余各组肠道内真菌菌群的组成及相对丰度差异较大，特有相对丰度显著高于各组平均值的真菌有Polarella、Phaeocystis、Pelagophyceae等。

图6 野生华北豹与圈养华北豹属水平上的物种丰度热图Fig.6 The abundance of fungal heatmap in wild leopard and captive leopard on genus

图7 LDA 值分布柱状图Fig.7 Distribution histogram based on LDA value

图8 进化分支图LichtheimiaceaeFig.8 Evolutionary branch graph

2.2.4 基于LefSe(LDA Effect Size)分析野外与圈养华北豹2组间的物种差异

采用LefSe分析野外与圈养华北豹2组间具有显著差异的物种(图7，图8)。LDA评分直方图(图7)显示各组间具有统计学差异的生物学标志，柱形图的长度表示LDA评分，红色代表野外组样品，绿色代表圈养样品。该图显示了野外与圈养组之间具有显著差异的微生物类群(LDA score>3.3)。在野外组中具有显著丰度差异的有：Coniochaetaceae科、银耳纲(Tremellomycetes)、小子囊菌目(Microascales)、子囊壳菌属；在圈养组中具有显著丰富度差异的有：毛霉门、酵母纲(Saccharomycetes)、毕赤酵母科(Pichiaceae)、酵母菌属(Saccharomyces)、毛霉目(Mucorales)、酵母科(Saccharomycetaceae)、环孢菌科(Inocybaceae)、根毛霉科(Rhizomucor)、德巴利(氏)酵母属(Debaryomyces)、酵母菌目(Saccharomycetales)、毕赤酵母属(Pichia)、丝盖伞属(Inocybe)、复膜孢酵母属、金丝酵母科(Debaryomycetaceae)、Lichtheimiaceae、复膜孢酵母科(Saccharomycopsidaceae)。进化分支图(图8)由内至外辐射的圆圈，显示了野外与圈养组在门至属(或种)水平的分类群相对丰度差异。每个不同分类的小圆圈表示一个分类单元，而每个圆圈的直径的大小反映了相对分度的高低。红色和绿色的圆圈分别代表了野生和圈养华北豹相对丰度差异，未标色的为无显著差异的物种。从图中结果显示，LDA值分布柱状图与进化分支图的结果是相符合的。

3 讨论

3.1 华北豹肠道真菌与其他动物的比较

本研究发现子囊菌门、担子菌门、毛霉门、壶菌门、芽枝霉门是华北豹肠道真菌的优势菌群，艾生权[5]等用RLFE法测得亚成体大熊猫肠道真菌主要为子囊菌门、担子菌门2个门，周本翔等[12]通过实验证明草鱼肠道中真菌同样以子囊菌门数量最多，其次是担子菌门。这些研究结果表明，至少在以上的几种动物类群间，其肠道真菌构成大致是相似的。

3.2 野生华北豹与圈养华北豹肠道真菌多样性的差异

真菌菌群占肠道总菌群的比例较小，但是对肠道的稳态平衡维持具有重要的作用[13]，肠道中的真菌与细菌关系密切，两者存在着稳定的拮抗、互利共生关系[14-15]，它们为彼此的生长发育提供支持和保护作用[16]。本研究发现，圈养华北豹酵母纲较野生华北豹丰富。酵母纲作用动物肠道的机理十分复杂，现仅见白色念珠菌属(Candidaalbicans)对肠道黏膜损伤之后致炎作用，但酵母菌属中的布拉酵母菌(Saccharomycesboulardii)是目前确认人类肠道益真菌，还未见到其对于猫科食肉动物的相关研究报道[17]。假单胞菌的生长、发育等活动与白酵母菌密切相关[18]。Kohl等[19]曾研究报道指出饮食并不是圈养动物微生物多样性减少的唯一原因，并指出圈养动物后代的肠道菌群与它们母亲的肠道菌群结构更相近。酵母菌属中的白色念珠菌是哺乳动物胃肠道中含量最多的一种真菌，有小鼠实验提示白色念珠菌的致炎作用更可能发生在肠道黏膜损伤之后[20]。Sokol等[21]通过观察235名IBD患者与38名健康者的粪便微生物群的细菌与真菌组成，发现IBD患者担子菌门与子囊菌门的比例增加，其中促炎真菌如白色念珠菌占比增加，抗炎真菌如酵母菌占比减少。

通过本研究积累了相关数据及资料，发现野生和圈养华北豹肠道真菌组成结构中毛霉门存在明显差异，这可能是由于野生与圈养条件下食物丰富度不同而导致的。因此饲养人员应当对圈养华北豹的食物构成加以改善，以免引起华北豹因食物单一而引发疾病。

本实验首次就圈养与野外华北豹肠道真菌菌群进行研究，目前国内外对本实验中检测到的一些真菌研究甚少，它们与机体及肠道微生态的相关性也不甚明确，无法就相关菌群在宿主肠道微生态中扮演的具体作用进行详细的分析，还要相关的后续实验进一步研究。