疏肝化瘀益气法对肝纤维化大鼠HIF-1α、VEGF表达的影响

张 禹，黄秋思，刘 定，杨沈秋

（黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001）

肝纤维化（Hepatic fibrosis,HF）是指肝脏遭到病毒性、代谢性、炎性和中毒性等诸多致病原侵袭，致使肝脏发生炎症反应，引起肝脏组织内细胞外基质过度增生与异常沉积，进而导致肝脏正常生理结构发生异常改变的病理过程，这种病理损害是多种慢性肝病向肝硬化进展的共同反应[1]。现代研究证实，肝纤维化早期是一种可逆性病变[2]，并且在临床患者中，这一结论也得到证实[3-4]。因此，及时有效的抗肝纤维化治疗对肝病预后具有重要意义[5]。

以病理性血管新生为特点的肝窦毛细血管化是肝纤维化进程中的重要病理表现。研究证明，低氧诱导因子-1α（Hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被认为在血管生成和重构方面发挥关键作用[6]。本实验将通过观察疏肝化瘀益气法为指导的软肝散对大鼠肝纤维化过程中HIF-1α、VEGF mRNA 表达的影响，并探究其防治肝纤维化的作用机制。

1 实验材料

健康的8～10 周龄清洁级雄性SD 大鼠46 只，体质量（200±20）g，给予标准饲料和饮用水，自由饮水饮食，且控制室内温度为（22±1）℃、相对湿度60%～80%，正常饲养适应7 d 后开始实验。软肝散组成：黄芪、柴胡、丹参、炙鳖甲、生牡蛎。德国莱卡2135 型切片机，美国moticam3000 显微摄影成像系统，Nikon Eclipse TE2000-E 倒置显微镜，HITACHI H-7650 透射电子显微镜，Fresco 低温冷冻离心机，电泳仪，Centrifuge 5415D 离心机，NC 膜，0.45 μm 孔径，ABI7500 荧光定量PCR 仪，无菌猪血清，BCA 蛋白定量试剂盒，丽春红染色液，蛋白酶抑制剂，山羊抗兔IgG（H+L），HRP，TRNzol 总RNA 提取试剂。

2 实验方法

2.1 建立模型 雄性清洁级SD 大鼠适应性喂养1 周后，给予腹腔注射未灭活的猪血清，每次0.5 mL/只，2 次/周，连续注射8 周。

2.2 动物分组 健康雄性清洁级SD 大鼠46 只，随机分为空白组4 只，软肝散干预组8 只，模型组34 只。

2.3 给药方法 空白组、模型组，给予生理盐水灌胃，1 次/d，至8 周末；软肝散干预组自造模开始即给予软肝散生药水煎剂灌胃，1 次/d。并于第2、4、6、8 周，分别处死2 只大鼠取材，造模结束后全部处死。

2.4 标本采集 取材前大鼠禁食不禁水12 h，然后用4%水合氯醛按10 mL/kg 剂量腹腔注射，麻醉后固定解剖。取出大鼠肝脏，观察肝脏的颜色、质地，切取约2 mm厚的肝组织放入10%中性福尔马林液中固定，常规制备肝组织切片，切片厚度约4 μm；另取1 mm3肝脏组织放入2.5%的戊二醛固定液中固定，于4 ℃冰箱保存；再分别取肝脏组织100 g 于液氮中速冻，再保存于-80 ℃超低温冰箱中。

2.5 检测指标及方法 HE、Masson 染色病理组织学观察，RT-PCR 方法、Western blot 法检测HIF-1α、VEGF 蛋白定量。

2.6 统计学方法 采用 SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验，等级资料比较采用非参数检验。

3 实验结果

3.1 HE 染色病理组织学观察 见图1。

图1 各组大鼠肝组织的病理形态变化（HE 染色，×200）

经HE 染色分析可见，空白组肝细胞板排列规整，胞质胞核染色清晰，未见炎细胞浸润和充血。模型组肝组织纤维化，并被增生纤维组织分割包绕成不同的区域，胞质胞核界限不清，胞质染色不均匀，肝细胞肿胀，局部深染或呈现脂肪样变性或液化性坏死灶；细胞核固缩或呈现分裂；散见炎细胞浸润或局部充血。软肝散干预组随着给药时间的增加，各时间点肝组织病理表现均有不同程度的减轻，2 周时病理变化主要以肝细胞脂肪样变性为主，有轻度的纤维化，4 周、6 周、8周时肝板排列逐渐规整，胞质胞核染色清晰，水肿明显减轻，有少量的炎细胞存在，未见明显的纤维组织增生。

3.2 Masson 染色病理组织学观察 见图2。

图2 各组大鼠肝组织的病理形态变化（Masson 染色，×200）

经Masson 染色分析可见，空白组肝细胞间可见少许的浅蓝色，面积很少且着色淡，主要分布在大的血管周围。模型组肝细胞间可见大量的深蓝色，且肝细胞周边也呈现蓝色，分布广泛且着色深，表明肝纤维化明显。软肝散干预组：给药预防组随着给药时间延长，肝脏蓝色的区域和深浅逐渐减少和减弱，表明肝纤维化程度逐渐减轻。尤以8 周组最为明显。

3.3 RT-PCR 方法检测HIF-1α、VEGF 结果表明，与空白组比较，模型组大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF蛋白的相对表达量均显著升高，且差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，软肝散干预组（2周）、软肝散干预组（4 周）、软肝散干预组（6 周）、软肝散干预组（8 周）大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF蛋白的相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），且随着干预给药时间的延长，HIF-1α、VEGF 蛋白的相对表达量逐渐降低，具体见表1。

表1 Real Time PCR 检测结果（）

表1 Real Time PCR 检测结果（）

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.4 Western blot 法检测HIF-1α、VEGF 蛋白定量 首先能检测到特异的阳性条带，内参检测的检测结果为正常阳性结果。采用Total Lab Quant V11.5（Newcastle upon Tyne,UK）软件扫描灰度值，统计分析蛋白的相对表达量。与空白组比较，模型组大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF 蛋白的相对表达量均显著升高，且差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，软肝散干预组（2周）、软肝散干预组（4 周）、软肝散干预组（6 周）、软肝散干预组（8 周）大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF蛋白的相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），且随着干预给药时间的延长，HIF-1α、VEGF 蛋白的相对表达量逐渐降低，具体见图3，表2。

图3 各组大鼠肝组织HIF-1α、VEGF 蛋白的表达（）

表2 Westem bolt 检测HIF-1α、VEGF 蛋白相对表达量结果（）

表2 Westem bolt 检测HIF-1α、VEGF 蛋白相对表达量结果（）

注：与空白对照组比较，## P ＜0.01；与模型组比较，△△P ＜0.01

4 讨论

肝脏血管新生与肝纤维化的发生机制有一定的相关性，在肝纤维化的病人和实验动物模型的肝脏，都发现明显的肝窦毛细血管化[7-8]。肝窦是肝血流和肝细胞间多种代谢物质交换的主要场所，毛细血管增生可以使肝细胞与血浆成分的交换出现障碍，进而导致肝细胞缺血缺氧，加重细胞损伤及肝星状细胞活化及细胞外基质异常沉积。

肝脏受到病原体侵袭后，肝脏会启动创伤愈合反应，由于细胞迅速扩增，需要大量的血流及营养供应，遂导致肝组织局部缺氧。缺氧可引起肝内血管重构，已有体内实验模型发现肝脏缺氧区域是肝脏血管新生发生的主要位置。低氧诱导因子（HIF-1α）是一种在低氧状态下发挥活性的特异核转录因子，通过调控低氧反应基因的表达介导细胞对低氧的应答，使组织细胞对缺血、缺氧作出适应性反应[9]。大量研究证明，在与缺氧相关疾病如肿瘤、感染、炎症反应、创伤等过程中，HIF-1α 作为参与机体应对缺氧代谢的重要转录调控因子，在细胞代谢和功能调节中发挥重要作用[10-11]。

在组织缺氧诱导因子（HIF-1α）的参与下，组织缺氧刺激肝脏细胞上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达。研究证明，VEGF可以调节内皮细胞成活和增殖，而作为VEGF 的上游调控因子，HIF 不仅能促进其表达和转录增强，还能增加VEGFmRNA 的稳定性，促进形成新血管，改善局部组织血供。HIF-1α 及其下游因子作为肝纤维化的重要调节因子，有望成为缓解肝纤维化的有效途径[12-13]。

肝纤维化属于中医“胁痛”范畴，从其病理特征来看，则属于肝络病范畴。现代医学认为，肝络是指分布在肝脏区域中小血管、微血管、微循环，能够濡养肝脏并调节肝脏代谢。这与肝窦的结构与生理功能不谋而合。肝络从经脉别出，因与肝血、肝气相通，故可分为血络和气络。血络如肝窦，承载和运输血液，气络如肝窦内的细胞，具有维持血络结构和提供动力的功能。由于肝窦与肝络密不可分的联系，从“络病”论治肝纤维化也成为一个重要的方向[14]。中医药抗肝纤维化具有明显优势[15]，对单味药及复方的研究颇多[16-18]。软肝散是治疗肝硬化腹水的临床经验方，主要由黄芪、柴胡、丹参、炙鳖甲、生牡蛎等组成，有活血化瘀、软坚散结、疏肝益气之效。在临床运用多年，取得较好疗效[19-20]。

以疏肝化瘀益气法为指导的软肝散可以缓解肝纤维化的病理改变，软肝散可能通过下调HIF-1α、VEGF表达，抑制HIF-1α、VEGF 蛋白的过表达，调控HIF-1α/VEGF 信号通路抑制肝组织纤维化进程，从而发挥抗纤维化的作用。