兔出血症病毒VP60蛋白研究进展

申识川 王文芳 张玉红

1.河南省濮阳市检验检疫服务中心，河南濮阳457000；2.河南省濮阳市河道管理处，河南濮阳457000；3.河南省濮阳市动物疫病预防控制中心，河南濮阳457000

兔病毒性出血症俗称“兔瘟”、兔出血热，是家兔及野兔的一种烈性、高致死性传染病，由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起，主要临床症状表现为呼吸系统出血、肝坏死及实质脏器水肿、淤血及出血性病变，以接触传播为主要传播方式。该病发病急、发病率和病死率较高，被我国兽医卫生行政部门列为必须检疫的二类传染病。

1 兔出血症病毒概述

兔出血症病毒在病毒学分类上属嵌杯病毒科兔病毒属成员，表面无囊膜，直径约40 nm，核衣壳呈20 面体对称，和其他病毒结构一样，由病毒基因组和180 个衣壳蛋白亚单位聚合而成[1]。病毒基因组为单股正链RNA，整个基因组包括7 437 个核苷酸碱基，基因组5’末端没有帽子结构，3’末端有一个短的多聚腺嘌呤尾，编码2 个开放阅读框ORF1和ORF2，分别编码结构蛋白和非结构蛋白。RHDV包括有血凝性和无血凝性2 种，目前在我国这2 种毒株均存在。

2 VP60 蛋白基因及结构

VP60 蛋白基因属于第1 个开放阅读框的一部分，第1 个开放阅读框位于病毒基因组5’的末端，从第10 个核苷酸碱基开始延伸至第7 041 个核苷酸碱基，编码1 个多聚蛋白前体，其中VP60 基因全长包括1 740 个核苷酸碱基。

研究表明，RHDV 的VP60 蛋白由多聚蛋白前体经蛋白酶裂解而成，包括579 个氨基酸，分子质量为60 ku，故名VP60 蛋白[2]，其结构主要分为3个区域，NTA（氨基端1～65aa）、S 区（66～229aa）和P区（238～579aa），第230～237aa 是S 区和P 区连接处存在的一段短的铰链区。P 区主要由P1 亚区和P2亚区组成，P2 亚区位于RHDV 衣壳蛋白表面，含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点[3]。

3 VP60 蛋白表达

VP60 蛋白是机体主要保护性抗原，为了进一步搞清楚VP60 蛋白的结构和功能，目前国内学者构建了多个VP60 蛋白表达系统，主要包括原核表达系统和真核表达系统。

3.1 原核表达系统

原核表达系统应用时间较长，技术成熟，表达量高、周期短，是早期研究VP60 蛋白的首选，也是应用最广的表达系统。

安凯等[4]克隆了RHDV GS/YZ 株的VP60 截短基因，构建了原核表达质粒pET-RHDV-VP60，转化大肠杆菌后表达出了VP60 聚合蛋白。将表达产物纯化后免疫Balb/C 小鼠制备多抗，然后应用间接ELISA 和免疫印迹试验对重组蛋白的免疫原性进行分析。结果表明GS/YZ 株VP60 截短基因在大肠杆菌中成功表达，表达产物分子质量约50 ku，其多抗效价为1∶32 000；免疫印迹试验证明表达产物具有很好的免疫原性；免疫重组蛋白后的易感兔在攻毒后全部存活，与传统灭活疫苗具有同样的保护效果，为研发亚单位疫苗提供了借鉴。

熊梅等[5]利用扩增RHDV 的VP60 全长基因，构建了重组表达质粒pGEX-VP60，转化大肠杆菌BL21，成功表达重组蛋白，后续的免疫印迹试验表明表达的病毒蛋白具有与VP60 单抗良好的反应原性。利用纯化后的VP60 蛋白与兔的肝脏细胞膜蛋白进行pull-down 实验，分析出与RHDV VP60 蛋白相互作用的兔肝脏细胞膜蛋白为ATP 合成酶β亚基，说明ATP 合成酶β 亚基可能与RHDV 的感染有关。

李传山等[6]应用利用原核表达载体pET32a 构建成功了RHDV 西北分离株VP60 蛋白的重组表达质粒，诱导大肠杆菌BL21 表达后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，VP60 蛋白成功表达，重组蛋白分子质量约为75ku。随后的免疫印迹试验证明，原核表达的VP60 蛋白具有免疫原性。该研究进一步表明兔出血症病毒在我国西北干旱半干旱的自然条件下其遗传变异和免疫学特征没有较大变化。

3.2 真核表达系统

张帅等[7]运用分子克隆技术，使用Hr1、Hr3、WPRE、SV40、CAG、Melt 等顺式作用元件及元件组合对pFastBacDual 供体质粒进行改造后转染sf9 细胞，成功提高了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60 在Bacto-Bac 系统的表达量。经免疫鉴定，表达的重组VP60 蛋白既能够和VP60 单抗发生反应，也能和RHDV 多抗血清发生反应，具有良好的反应原性。

原冬伟等[8]、张夏兰[9]分别将RHDV TP 株、Yaan株的VP60 基因扩增，插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，成功构建真核表达质粒pcDNA-VP60，转染RK13 细胞和Vero 细胞后都表达出了VP60蛋白。随后他们又用重组质粒分别免疫了小鼠和1月龄试验兔。动物试验表明，重组质粒能够诱导动物机体产生保护性抗体。

陈柳等[10]利用杆状病毒表达系统对RHDV VP60蛋白的表达和细胞定位进行了研究。研究结果表明，VP60 蛋白能在sf9 昆虫细胞中正确表达，能自组装形成病毒样颗粒；表达的VP60 蛋白定位于sf9细胞的细胞膜上，VP60 蛋白可能有助于RHDV 感染并入侵宿主细胞。

4 VP60 变异研究

向华等[11]、田浪等[12]克隆出了国内RHDV 不同分离株的VP60 基因，与GenBank 上的其他毒株进行了比较，他们的研究结果表明，VP60 基因序列全长都是1 740 bp，都是编码579 个氨基酸，各毒株核苷酸序列同源性在90.0%到98.0%之间，氨基酸同源性在94.1%到99.0%之间，强毒株间的氨基酸同源性为95%～100%，氨基酸变异多发生于C、E区，且氨基酸变异没有引起VP60 蛋白高级结构的根本性变化。

陈铭等[13]应用RT-PCR 方法克隆出了RHDV 荣昌分离株的VP60 主要抗原表位基因序列，测序后，与RHDV 其他16 株的主要抗原表位序列进行了比较分析，研究结果表明RHDV 荣昌分离株的主要抗原表位基因大小为506 bp，与其他16 株的核苷酸序列同源性较高，推导的氨基酸同源性可达80%。

5 展 望

VP60 蛋白是RHDV 的结构蛋白，在感染宿主和诱导机体免疫应答过程中起着重要的作用，是国内外研究RHDV 的一个热点和重要内容，除了原核表达和真核表达之外，也有学者尝试在马铃薯中表达该蛋白。随着生命科学技术的发展和研究手段的更新，关于VP60 蛋白的结构、在感染宿主中的作用和刺激机体产生保护性抗体的机理将会更清楚，也会促进学者研发出更有效的RHDV 疫苗和诊断试剂，更有助于RHDV 的防控和治疗，降低养兔业的损失，保障我国养兔业健康发展。