长链非编码RNA在早产儿视网膜病变中的作用研究进展△

王月 王雪 底煜

早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)是一种视网膜血管增生性病变，在早产儿与低体质量儿中多有发生，是目前我国儿童致盲的主要原因。对于ROP的发病机制虽有待于进一步研究确认，但是目前尚有研究认为视网膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)生成的主要因素为相对缺氧，并且针对相对缺氧机制开展了大量的研究[1]。抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)单克隆抗体在视网膜新生血管相关疾病中的应用使ROP的治疗出现了革命性的改变，其可有效保护患儿的视力[2]。但是，目前抗VEGF药物治疗ROP仍属于超适应证用药，反复应用有增加患心血管疾病的风险[3]。抗VEGF药物对患儿发育的影响以及安全性问题引起了广泛关注，其安全性以及安全剂量仍需进一步探索。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)为长度大于200个核苷酸，并且基本不编码蛋白质的转录本。近十余年研究发现，lncRNA在生命体不同的生物进程中均发挥着不同功能，包括疾病的发生、细胞周期、干细胞分化等,以RNA的形式实现基因水平调控。lncRNA主要在表观遗传、转录以及转录后修饰等不同层面发挥着重要功能[4]。研究发现,lncRNA影响早产儿眼部的发育，在ROP的发生发展中发挥重要作用[5]。通过对不同成熟时期的视网膜全基因组表达谱及逆行分析，发现部分保守lncRNA在视网膜发育过程中表现出动态表达趋势[6]。眼具有良好的药物代谢功能，基于目前lncRNA在ROP中的研究，基因治疗有望使机体长期稳定安全地生成内源性抑制血管生成的细胞因子，从而有效治疗视网膜新生血管疾病，避免反复应用抗VEGF药物，降低对早产儿生长发育的影响[7]。

1 lncRNA在ROP的表达与功能

Chen等[5]通过对眼组织不同部分的lncRNA表达进行研究发现,lncRNA在角膜、晶状体以及视网膜中呈现出高表达状态，并且提供了在不同时期不同组织中的表达谱，认为lncRNA具有控制基因表达的作用，调控组织的复杂性。Smith等[8]在针对氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)小鼠模型的研究表明，小鼠RNV有血管闭塞期以及新生血管形成期。蒋沁等[9]通过微阵列芯片分析发现，在2个新生血管发生与发展的不同时期,分别有326种和51种lncRNA的差异表达。应用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)数据库分析结果表明，在这2个阶段,有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路是最重要的信号富集途径，参与多种病理生理反应，促进新生血管的生成。

彭芬等[10]采用高通量测序技术研究OIR模型视网膜lncRNA 表达谱，结果提示1118条lncRNA与其相关，其中950条表达上调，168条表达下调。进一步针对其中6条lncRNA进行研究发现，存在潜在靶基因调控新生血管的形成，具有代表性的有碱性成纤维细胞生长因2 (fibroblast growth factor 2，FGF2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、受体酪氨酸激酶样孤儿素受体β等。张劲松等[11]利用Arraystar Human LncRNA array (Version 2．0)对人脐静脉内皮细胞、人视网膜色素上皮细胞、人成纤维细胞、人脉络膜内皮细胞以及人视网膜内皮细胞提取的RNA分别进行测序，筛选出在内皮细胞中表达比非内皮细胞高2倍的lncRNA，发现内皮细胞富含的lncRNA与胚胎发育以及血管的发育相关度更高。漆晨等[12]通过建立OIR小鼠模型，针对蛋白表达谱进行分析发现，在OIR模型和正常组小鼠的眼组织中，细胞因子血小板因子4(platelet factor 4,PF-4)、P选择素(recombinant P-selectin，SELP)、血管内皮生长因子A、CXC趋化因子配体16(CXCL16)、可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNF-R) II和血管细胞黏附因子(VCAM)-1呈现显著差异性表达。

2 lncRNA参与ROP的相关研究

lncRNA在RNV形成的细胞增殖、细胞运动以及视网膜血管在视网膜的发育以及视功能的维持中均具有十分重要的作用。但是视网膜无功能血管的生长和消退会伴随缺血性疾病的发生，ROP主要病理改变为视网膜新生血管的形成,最近一项研究结果表明,生理血管生成和病理新生血管可能遵循不同的路径[13]。lncRNA凋亡的过程中均有参与，在炎症免疫调节中发挥重要作用[14-15]。另外，lncRNA通过调控VEGF的表达而促进RNV的形成也是ROP的重点研究领域[16]。

2.1 lncRNA参与VEGF表达的调控lncRNA参与VEGF信号转导通路的调控已经得到证实，在视网膜内皮细胞上，lncRNA心肌梗死相关转录本(myocardial infarction-associated transcript ,MIAT)可以作为一个竞争性内源RNA吸附miR-150-5p干预miR-150-5p与VEGF mRNA的结合，最终实现VEGF水平的调节[9，17]。研究发现，神经纤维网蛋白1具有多种功能，在新生血管的形成、轴突导向、细胞存活、迁移及侵袭等功能中均有参与，平滑肌和内皮细胞富集的迁移/分化相关的非编码长链RNA (smooth muscle and endothelial cell-enriched migration/differentiation-associated long noncoding RNA,SENCR) 在脉络膜新生血管表达的实验研究中发现，神经纤维网蛋白1是VEGF和信号素蛋白3A脑信号蛋白所共有的膜结合受体[11]。在RNV患者的房水中检测到lncRNA-Vax2osl和lncRNA-Vax2os2表达上调，与VEGF上调趋势相符合，提示上述2种lncRNA在RNV的形成中发挥的作用与VEGF相似。

通过KEGG Pathway数据库分析，推测PI3K-VEGF信号通路与ROP相关[18]，与CYR61-PI3K/AKT信号促进OIR小鼠RNV形成的结论相符[19]。沉默高半胱氨酸能够有效抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinase / serine threonine kinase，PI3K)信号通路，减少RNV的生成。PI3K抑制LY294002通过阻断P13K/AKT信号通路，能够下调视网膜VEGF的表达,抑制RNV的形成[20]。在心肌缺血-再灌注过程中，FGF2可通过激活胞外信号调节激酶1/2和PI3K信号通路，抑制FGF2内质网应激反应和线粒体损伤[20]。研究显示，FGF2与PI3K 通路相关[6]。

2.2 lncRNA参与早产儿视网膜细胞增殖、迁移与凋亡牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)是一种剪接的多聚腺苷化RNA，在发育中的视网膜和大脑以及成人组织中都有表达,参与视网膜发育及光感受器形成[21]，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)具有清除体内过剩氧自由基的作用，有助于判断生物体抗氧化损伤。研究表明,SOD1能够对内皮释放一氧化氮的功能进行抑制而达到保护内皮细胞的作用，若细胞内缺乏SOD1，内皮细胞的正常功能会受到影响，促进凋亡。敲低lncRNA-TUG1表达能使SOD水平升高，降低人脐静脉内皮细胞凋亡率[22]。

MAPK是细胞内信号传递的主要通路，细胞的凋亡与增殖均与其激活物相关，在细胞实验中，MIAT下调可以显著降低内皮细胞增殖和细胞活性[23]。在研究MIAT表达沉默对体外内皮细胞功能影响的实验中发现，在高氧胁迫时以及低氧胁迫时，MIAT的表达沉默均能显著降低内皮细胞活力，加速细胞凋亡，明显减少线粒体去极化，明显增加死亡细胞数量[24]。敲除人肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1) 使磷酸化水平P38明显降低，沉默P39/MAPK通路，应用P38/MAPK通路抑制剂能够阻断MALAT1诱导的细胞增殖过程。

midkine(MDK)又称神经轴突生长因子2，是低分子量肝素结合生长因子的一种，主要参与妊娠中期视黄酸应答反应基因的发育，MDK对于细胞增殖、迁移以及新生血管的生成均具有促进作用，在评估内皮细胞的迁移、增殖与分化情况时，通常采用纤维细胞与内皮细胞共培养的实验，实验结果表明，Si-MDK能够显著减少血管的生成。下调lncRNA-SENCR后，MDK的表达显著增强，另外，转染siRNA实现干扰MDK表达，下调MDK的同时，发现SENCR的表达明显上调，二者之间呈负相关[11]。下调lncRNA-SENCR能够增加血管内皮细胞的迁移率，促进细胞的增殖，促进形成血管管腔，使毛细血管网的形成加速。

2.3 lncRNA参与调节早产儿视网膜炎性新生血管的生成炎症因子对于细胞的迁移以及成管能力具有不同程度的促进作用，在lncRNA-MIAT对细胞成管能力影响的实验研究中，MIAT刺激组与单纯使用炎症因子刺激组相比，刺激细胞的成管能力以及细胞迁移能力明显降低[23]。在动物实验中，通过下调MIAT能够减少RNV形成，同时减轻炎症反应和血管渗漏的情况。与正常血管的形成比较，无功能新生血管的生成为视网膜内皮细胞受到环境中细胞因子和炎症因子的刺激而发生增殖和迁移的过程[9]。另外，lncRNA-MALAT1能够通过与核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的相互作用调节脂多糖诱导的炎症反应。

位于编码同源框转录因子腹前同源框2(ventral anterior homeobox 2，Vax2)基因反义链上的lncRNA-Vax2os主要有5种亚型。lncRNA-Vax2osl以及lncRNA-Vax2os2在RNV形成的模型中呈现出异常表达，在伴有脉络膜新生血管形成的患者房水中也呈现异常表达状态。根据研究结果针对转录因子结合位点行预测检查，发现这2种基因亚型以顺式作用元件分别参与NF-κB和转录因子C-Rel在细胞迁移、侵袭和血管生成过程中的致炎作用[25]。

母系印记基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)参与RNV的形成，通过实验测定经过氧化损伤处理的内皮细胞中MEG3的表达水平，发现其明显下调，通过敲除MEG3基因能够使视网膜血管功能出现异常，增加炎症反应及血管的渗漏，敲除MEG3促进RNV管腔生成，这一过程主要受PI3K/Akt信号转导通路调控[4]。

2.4 lncRNA参与早产儿视网膜血管内血小板系统的激活实验证明,在增生型糖尿病视网膜病变患者的玻璃体中PF4显著上调[26]。在近期关于OIR模型的蛋白表达谱的研究中发现，在OIR小鼠眼内有血小板系统被激活，进一步证明了在RNV形成过程中，在受损的血管壁附近，血小板被激活，促进PF-4的释放[12]。另外PF-4对于巨噬细胞内NF-κB水平的增加有正向调节作用，促进基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)的转录。在血管重塑过程中，炎性细胞能够作为血管组织MMP-9的重要资源，参与调控[27-28]。PF-4所属半胱氨酸基元趋化因子家族，不仅具有阻止促血管生成因子与受体结合形成二聚体的作用，对于VEGF和单核细胞趋化蛋白-1诱导的MAPK-ERK通路的活化也有一定的抑制作用，进而抑制新生血管的生成。SELP为血小板表面黏附分子，激活血小板能使SELP表达显著上调，由此推断，SELP有可能通过促进早期炎性单核细胞浸润而加重缺血，进而诱导RNV的生成[12]。

3 lncRNA在ROP治疗中的应用与发展

ROP临床治疗主要采取玻璃体内注射抗VEGF药物以及视网膜激光光凝治疗，但大多数患者需要长期维持治疗，并且有部分患者对注射抗VEGF药物作用不明显。基因治疗已经被引入众多学科中，与其他器官相比，眼部免疫作用比较薄弱，加之ROP发生与发展的时间窗比较短，这为基因治疗提供了良好的条件。近期有研究表明，玻璃体内注射Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)拮抗剂TAK-242可减少非渗出区域，抑制异常血管生成，并改善OIR小鼠视网膜的血管密度，TLR4-MAP4K4通路可以通过独立于血管内皮生长因子的机制调节视网膜新生血管[29]。OIR状态下血小板系统处于激活状态，而促炎因子表达下调，表明PF-4可能成为针对RNV的VEGF非依赖型治疗策略的新靶点[12]。此外，lncRNA-SENCR对血管内皮细胞表型的影响[11]、lncRNA-MIAT对miR-150-5p的竞争性吸附[17]、 lncRNA-MEG3调控VEGFR2的表达[30]以及FGF2与PI3K通路之间的作用关系等都为RNV生成的研究提供了新视角。

目前，关于lncRNA在ROP治疗的研究中，有众多先进的治疗思路，均具有相应的参考价值，多数新靶点的提出皆需要反复实验来验证。深入研究多种基因水平表达的内源性血管生长抑制物，为ROP的临床治疗提供最佳治疗方案是十分必要的。