不同种类声敏剂联合超声的抗肿瘤效果及作用机制研究进展

林默楠，吕岩红综述，郑金华审校

0 引 言

声敏剂是一类可预留在肿瘤局部，被超声激活，可使肿瘤部位产生一系列声化学反应和生物学效应，从而达到抑制和杀伤肿瘤细胞目的的化合物[1]。二者联合的抗癌疗法，称为声动力治疗(sonodynamic therapy, SDT)。与传统的抗癌疗法相比，超声联合声敏剂的抗癌治疗具有无创性、靶向性强和方便操作等优点。与新型肿瘤疗法如生物疗法相比[2]，SDT疗法相对简单可控，如果获得临床应用，将适用于治疗患有深部肿瘤或不能耐受手术和放、化疗的癌症患者。在这一疗法的发展过程中，有人选用高能量超声(频率>1 MHz，强度>3 W/cm2)，特别是高强度聚焦超声与声敏剂结合。但由于高强度聚焦超声波可使靶区组织温度骤升至65100 ℃，导致组织细胞内的蛋白质出现变性或凝固性坏死，进而使机体产生不良的免疫反应[3]。目前，学者们更多地选用低能量非热超声(≤1 MHz，≤3 W/cm2)，不仅能激活声敏剂达到抑瘤效果，还能最大限度地减轻超声对正常组织的不良反应。利用超声非侵袭、无毒性且便于定位局部深层组织的特点，因此在临床的应用上具有广泛的空间[4-5]。可以被定义为声敏剂的化合物在一定剂量范围内对组织细胞无毒或毒性较小，但与超声结合可显示出协同增强的抑癌作用。研究表明，声敏剂的种类、结构、浓度、溶解性、体内代谢时间、在肿瘤细胞内富集程度及亚细胞作用位点的不同均可影响SDT的作用效果和抑癌机制[4-6]。因此，开发用于肿瘤治疗的理想声敏剂是SDT疗法必须解决的重要问题之一。用作肿瘤SDT治疗的理想的声敏剂应该具备本身无毒、具有良好的组织相容性；体内给药方便，不在体内长时间滞留；低或无光毒性；有较强的声敏活性，并具有化学的纯性，可以迅速从体内排出等特点。本文从不同种类声敏剂的生物化学特点对其联合超声的SDT治疗效果影响的角度，比较了卟啉类及非卟啉类化合物与超声联合杀伤肿瘤细胞的声化学及生物机制的异同点，为声敏剂的设计开发、声敏剂的基础实验研究提供可能的指导和理论基础。

1 卟啉类化合物及其衍生物与超声联合的抗肿瘤效果及机制

卟啉类化合物是一类由四个吡咯类亚基的α-碳原子通过次甲基桥相连而成的平面环状共轭体系，以卟吩为其共同结构，连有不相同侧链的卟吩称为卟啉。卟啉及其衍生化合物广泛存在于生物体内和能量转移的相关的重要细胞器内，因其具有较好的生物相容性和低细胞毒性，是理想声敏剂的候选。

1.1血卟啉和光卟啉Ⅱ血卟啉(598.7 g/mol)是由血红蛋白酸水解后产生的内源卟啉，可从血液中提取，是最早被发现具有声敏活性的物质。研究报道特异聚集于肿瘤局部的血卟啉，在超声作用下可诱导肿瘤细胞线粒体产生单线态氧(1O2)，引起肿瘤细胞凋亡[7]。光卟啉Ⅱ(1179.385 g/mol)是多种卟啉单体和多聚体的混合物，光卟啉Ⅱ(2.5 mg/kg和5.0 mg/kg)结合超声(3和5 W/cm2)可将肝癌AH130鼠移植瘤的大小抑制在10 mm之内(长短径平均值)，最高抑制率达75%以上，同时，光卟啉Ⅱ也表现出选择性地在肿瘤组织中累积的特点[8]。然而，由于光卟啉Ⅱ不溶于水，导致其在血液中的消除速度快于肿瘤中的累积速率，因而在体内肿瘤部位聚集的效率较低。上述研究显示血卟啉和光卟啉Ⅱ介导的SDT中使用的超声的强度以及药物剂量都相对较高(2 MHz，2 W/cm2和3 W/cm2)，表明这两种声敏剂的声敏活性较低。

1.2血卟啉单甲醚(haematoporphyrin-monomethyl Ether，HMME)和原卟啉IX(protoporphyrin IX，PpIX)HMME(612.727 g/mol)和PpIX(562.67 g/mol)都是由血卟啉的卟啉单体混合物进一步纯化而分离出的物质，被称为血卟啉衍生物。HMME能够分布至肿瘤细胞的线粒体中，被超声激活产生活性氧，进一步诱发线粒体介导的凋亡的发生[9]，并在同一实验中可观察到肿瘤细胞中钙离子的失调和caspase-3等凋亡相关蛋白的表达和肿瘤细胞凋亡。此外，高浓度HMME(120 μg/mL)联合超声导致细胞坏死，但相关机制不清[10]。

药物代谢的体外实验显示，外源性PpIX孵育60 min，细胞内PpIX的富集水平最高，当PpIX被超声激活后可与分子氧相互作用产生具有细胞毒活的活性氧，特别是1O2，导致细胞膜的破坏，体内外的实验证实这一破坏将影响线粒体的功能和导致染色质的凝集，导致肿瘤细胞G2/M期阻滞的同时，通过Fas信号通路诱导肿瘤细胞的凋亡，从而引起靶向肿瘤组织不可逆性的损伤[4, 11]。2.5 mg/mL(～4000 μmol/L)的血卟啉，20 μmol/L的PpIX以及60 μg/mL(～96 μmol/L)的HMME与强度1～2 W/cm2超声结合作用于不同肿瘤细胞，均显示出50%以上的肿瘤抑制率。提示使用浓度较低的PpIX和HMME具有更好的声敏活性[12-13]。但两者受限于易产生光毒性、在生物体内的相容性差等缺点，许多研究者利用微泡和纳米技术来提高它们对肿瘤细胞的亲和性以及代谢率，以理想声敏剂为标准来提高它们在SDT中的应用价值。

1.35-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)5-ALA(131.131 g/mol)是内源性PpIX的小分子代谢前体，比PpIX更容易进入细胞[4]。在正常情况下，机体内的5-ALA受到反馈调节的控制，体内没有过量的5-ALA蓄积，但当外源性5-ALA进入体内后，能被恶性肿瘤细胞选择性吸收，在恶性肿瘤细胞内合成过量的PpIX。与传统的卟啉类声敏剂相比，5-ALA不具有卟啉的四重吡咯结构，避免了其疏水性。5-ALA的这种特性使其在鼠的体内实验中可以进行多种给药方式：如腹腔注射，经胃途径和口服等[14]。相关的对比实验显示[4]，5-ALA产生的内源性PpIX对小鼠肉瘤S180细胞的毒性高于同浓度的外源性PpIX，当超声强度为3 W/cm2时，二者结合超声可显著抑制肿瘤细胞的活性，但二者联合治疗的肿瘤抑制率并未有显著差别。同时发现外源性PpIX在孵育细胞的1 h后，不再进入(附着)细胞，而5-ALA在细胞内产生的PpIX浓度在12 h内随着孵育时间不断增加，单独应用5-ALA对细胞的毒性更强，说明5-AlA产生了其他额外效应，声动力效果不及PpIX。并且这些研究都显示，5-ALA结合超声可诱导活性氧和脂质过氧化物的产生，引起肿瘤细胞内线粒体膜电位的丧失，抑癌作用与线粒体凋亡机制有关[14-16]；另一方面，由于5-ALA在不同细胞周期内源生成PpIX的量不同，线粒体凋亡途径受细胞周期蛋白Cyclin A的调控[6]。由于5-ALA本身不具有光敏特性，避免了直接应用卟啉类声敏剂产生的光毒副作用，并且可以有多种体内给药方式，因此，在SDT治疗中具有较好的应用前景。

1.4卟啉衍生物早期通过对卟啉衍生物:镓卟啉(1176.115 g/mol)，DCPH-P-Na(I)(797.645 g/mol)和锰卟啉(～858.800 g/mol)的特性的研究进行对比，发现它们对超声的敏感性不同。镓卟啉在肿瘤中的浓度显著的大于血浆、皮肤和肌肉，单线态氧在镓卟啉介导的SDT诱导肿瘤细胞的凋亡中起重要作用[17-18]。与镓卟啉相比，DCPH-P-Na(I)在同波长光激发下的荧光值较小。DCPH-P-Na(I)可由PpIX二甲酯合成而来，其具有一定的细胞毒性和低光敏感性，同时单线态氧的产生和诱导细胞凋亡也是DCPH-P-Na(I)介导SDT导致肿瘤细胞死亡的主要原因[19]。锰卟啉也是另一种基于卟啉结构而进行修饰的衍生物，锰卟啉介导的SDT在体外实验中显示出能够诱导细胞坏死而非细胞凋亡的能力。体内动物实验的数据显示锰卟啉在联合超声能够显著地抑制肿瘤生长，并且没有出现由于光敏感性而导致的皮肤毒性[20]。上述研究提示，通过适当的结构修饰可消除或降低声敏剂的光毒性。

1.5华卟啉钠研究人员通过对一代光敏剂卟啉类各种衍生物的进一步筛选和纯化，发现一种通过醚键连接的卟啉二聚体具有很强的光敏性和声敏性，被命名为华卟啉钠(sinoporphyrin sodium，DVDMS，1230.65 g/mol)[21-23]。自2012年DVDMS被合成以来，对其性质和作用效果进行了一系列研究。与血卟啉和PpIX相比，DVDMS具有更高的吸收效率，与超声结合可产生更多的活性氧，导致更强的线粒体损伤[5]。DVDMS-SDT治疗的体外实验显示，在相同的浓度和孵育时间下，DVDMS在S180细胞中产生的荧光强度显著高于血卟啉和外源性PpIX[24]。在ECA-109细胞中，DVDMS的荧光强度是血卟啉、PpIX和光卟啉Ⅱ的10倍，1 μmol/L的DVDMS联合超声对细胞的活性的抑制率大于50%，而血卟啉则需要32 μmol/L与超声结合才能产生等效抑制作用，暗示了DVDMS在肿瘤细胞的高效富集，使其能够发挥更强的抗肿瘤作用[5]。此外，有研究报道DVDMS介导的SDT在处理H446 小细胞肺癌细胞时抑制了坏死性凋亡的发生，且对各器官转移有显著的抑制作用[25]。最近的研究显示，DVDMS参与的SDT治疗对肝癌细胞的促凋亡作用与活性氧的生成和肿瘤抑制基因p53的表达相关[22]。研究表明与正常的组织细胞相比，DVDMS更倾向分布于肿瘤细胞且在肿瘤组织中有较长的滞留时间，这证明DVDMS具有很好的脂溶和水溶的两亲性，同时对肿瘤细胞具有选择性[5]，这些性质让DVDMS相比于其他卟啉类化合物和衍生物，更具有临床应用的潜质。同样的，最近的实验通过纳米技术对DVDMS进行修饰，但是这一实验不仅进一步增强了修饰声敏剂的SDT效率，更增加了声敏剂的成像检测能力[26]。

2 非卟啉类化合物与超声联合的抗肿瘤效果及机制

非卟啉类化合物包括氧杂蒽类、非甾体类抗炎药、第二代喹诺酮类抗生素、化疗药物、染料色素和无机纳米粒子等，与超声结合也表现出协同增强的抗肿瘤作用。目前还没有具体证据表明非卟啉类化合物在超声激发下是如何表现出声敏活性，推断高能π键在其结构中起着重要作用。

2.1氧杂蒽类氧杂蒽类化合物，主要是一些以氧杂蒽环为骨架的染料，包括荧光素、曙红和罗丹明。其中在抗肿瘤治疗中研究最为广泛的是荧光素玫瑰红(rose bengal，RB，1017.628 g/mol)，其细胞毒效应能被超声明显增强，并产生单线态氧等活性氧类物质。在星形胶质细胞的小鼠移植瘤模型中发现由RB结合聚焦超声，在不伤及正常脑组织的情况下，通过破坏细胞间连接，增强了单纯超声辐照对鼠颅内恶性星形胶质细胞瘤的抑制作用[27]。进一步的研究显示，经修饰的双亲性的RB衍生物与超声联合具有更好抗肿瘤效果，其衍生物之一RBD3与RB本身相比，在联合超声的作用下产生的单线态氧的数量和对S180细胞抗肿瘤效应增加了一个数量级[28]。

2.2化疗药物和抗生素关于超声能够增强化疗药物的作用一直备受学者们的关注。目前已被证实具有声敏活性的抗肿瘤药物有多柔比星(543.525 g/mol)和顺铂(300.046 g/mol)等化疗药物[29-30]。由于它们本身具有细胞毒性，因此，声敏性可能是一种附加的增强作用。相关的实验表明，多柔比星结合超声可增强超声的空化作用、诱导活性氧和羟自由基生成、DNA损伤和细胞凋亡[31]。进一步体内实验的研究表明，多柔比星可以通过降低SHH和Gli-1来降低MMP-2/9在瘤周组织中的表达，导致胶原蛋白在细胞外基质中沉积，抑制肿瘤细胞的生存和入侵，表明多柔比星介导的SDT能够同时影响细胞外基质的沉积和肿瘤细胞的活性[30]。此外，最近发现一些具有抗癌作用的中药成分，如野黄芩苷(462.37 g/mol)等，与低强度超声结合也可增强其抗癌效果[32]。

第二代喹诺酮类抗生素，如环丙沙星(331.35 g/mol)等联合超声也具有协同的抗肿瘤效应[33-34]。研究表明，含氟和甲氧基的喹诺酮类化合物可在超声的作用下首先生成自由基。并且，喹诺酮类抗生素单独作用S180细胞，没有细胞毒性，但结合强度为2 W/cm2的超声后，肿瘤细胞的存活率随超声辐照的时间明显降低[33]。

2.3染料、色素和无机纳米材料酞菁染料(～1168.626 g/mol)作为光动力治疗的第二代光敏剂，具有平面大环共价系统，和卟啉环类似，也作可为声敏剂用于SDT的研究。邻苯二甲酰亚氨基酞菁锌染料是一种具有锌原子配体的酞菁类衍生物，研究发现，它能明显增强超声对人U251神经胶质瘤细胞的杀伤作用[35]，抗癌机制涉及活性氧的产生和随后发生的线粒体及死亡受体5途径介导的细胞凋亡。

其他一些染料，如亚甲基蓝(319.851 g/mol)、吖啶橙(265.36 g/mol)、吲哚箐绿(774.967 g/mol)和竹红菌素B(～542.50 g/mol)，在与超声联合治疗肿瘤中显示具有一定的声敏性，并能够诱导细胞凋亡的发生[36-37]。例如，竹红菌素B被超声激活可使细胞产生活性氧，并诱导SGC7901和抗药型SGC7901/ADR胃腺癌细胞的凋亡[36]。此外，在光动力治疗中使用的姜黄素(368.385 g/mol)、大黄素(270.24 g/mol)和富勒烯(～1000 g/mol)等也被发现具有不同程度的声敏活性[38-41]，分别能够导致细胞自噬、凋亡和坏死的作用。

最近几年，研究者们不仅将纳米技术应用于对现有声敏剂的修饰上[26, 42-44]，同时，也发现一些无机的纳米分子可以直接作为声敏剂应用于SDT治疗[45-47]。例如，通过修饰过的二氧化钛(79.9 g/mol)纳米颗粒，解决它在体内的生物兼容性问题，与超声联合应用能够诱发肿瘤细胞产生活性氧，诱导肿瘤细胞凋亡[48]，亦可致肿瘤局部组织坏死[49]。

值得注意的是，不同于卟啉类声敏剂，许多非卟啉类声敏剂本身具有一定的细胞毒性，不完全具备作为SDT治疗理想声敏剂的特点。这类声敏剂在介导SDT时具有增强的抗癌作用可归因于超声的声孔效应，需要我们进一步深入研究。

3 结 语

声敏剂联合超声的SDT治疗作为一种新的非侵入性治疗方法，近年来备受学者们的关注。利用体内、外的实验所得到声敏剂的吸收峰值，以及声敏剂在细胞内的定位，使研究人员掌握最佳治疗窗口。大量的细胞和动物实验显示，不同种类的声敏剂结合超声作用于不同的肿瘤细胞可产生不同的声化学反应，如空化效应和声孔效应。其中90%以上的声敏剂联合超声会产生单线态氧和羟基自由基等活性氧簇。这些活性氧簇的产生，会对局部的肿瘤组织和细胞产生不同形式的损伤[4]；例如对细胞膜的损伤诱发膜受体凋亡的发生[11]，对线粒体的损伤诱发内源性凋亡的发生[16,50]，以及诱导肿瘤细胞坏死或自噬等。由于动物试验结果只能证明声动力方法的有效性而不能根据动物试验的结果来制定对人的治疗方案。未来可利用世界上认同的动物(载脂蛋白E基因敲除鼠或猪模型)探究声敏剂的肿瘤靶向性和剂量等治疗数据，将为人类治疗肿瘤设计提供必要的声敏剂参数。

因此，我们在筛选适合不同肿瘤细胞超声参数(对正常组织器官无或低杀伤效应，联合声敏剂诱导肿瘤细胞的死亡方式以凋亡为主)的同时，应对不同声敏剂的结构、化学性质、生物体组织和细胞代谢等方面与SDT不同的促肿瘤细胞死亡方式关系的进行探索，深入理解SDT的作用机制，为可用于临床治疗的声敏剂的设计、研发及化学合成创造条件。