血凝和血凝抑制试验注意事项

郭 燕

江苏省泰兴市滨江镇兽医站，江苏泰兴225400

随着规模养鸡业的迅速发展和养殖户科学养殖意识的增强，实验室检测技术越来越重要。血凝和血凝抑制试验是实验室常用的免疫抗体检测技术之一，主要用于鸡新城疫和禽流感病毒病的检测诊断以及监测鸡的免疫状态。笔者结合日常实验室操作，浅谈该试验应注意的事项，以供参考。

1 1%鸡红细胞悬液配制

采血应选用3 只SPF 公鸡或无新城疫、禽流感病毒抗体的健康公鸡，其目的是为了避免某些鸡只的红细胞可能出现自凝现象。采血后将血液迅速加入含抗凝剂的容量瓶中混合均匀，抗凝剂与血液的比例为1:4。离心操作中，注意在离心管加入PBS 液混合时不要用力，防止红细胞破裂产生溶血。以2 000 r/min 的速度离心5～10 min，离心次数不宜过多，3 次即可。每次离心后，用吸管吸去上层清液和白细胞膜。白细胞膜吸除得越干净越好。配置好的鸡红细胞悬液放置后若出现上清液呈红色，说明有溶血，不可使用。

2 试验器材的准备及操作

血凝和血凝抑制试验主要用到的器材有96 孔V 形微量反应板、单道或多道微量移液器、吸头、恒温培养箱、微量振荡器等。试验过程全部无菌操作，试验人员注意安全，做好自身防护。选用清洁干燥的反应板，移液器吸头尽量选用合格的一次性产品，一个吸头只能移取一种溶液。移液器在使用前先进行检查校正，每个吸头要牢固固定，以防操作过程中漏气或掉落。使用时操作要规范，先按下移液器，再将吸头放入反应孔中吸取样品。移液器吸头要垂直悬空加入液体，避免接触反应板和孔壁。操作要稳，手每次按压的力度要均衡，确保移液量的准确。样品稀释过程中，使用移液器在反应孔中吹打几次，混合均匀后再吸取移至下一孔。吹打时移液器吸头不要离开样品液面，防止产生气泡影响移液量。

3 血凝价的判定

在红细胞各组对照孔均正确的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集，能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数即为该病毒的凝集价。

4 4 单位抗原的配制

根据获得的血凝价进行4 单位抗原的配制，4单位抗原的稀释倍数为血凝价除以4，假设测得的血凝价为8log2，4 个血凝单位则为6log2，将抗原做64 倍稀释即可。也就是取1 mL 病毒抗原加入63 mL PBS 液中即为4 单位抗原。4 单位抗原最好现用现配。

5 抗原回归试验

4 单位抗原是血凝抑制试验中尤为重要的一个环节，其准确性决定了血凝抑制试验的结果。为防止4 单位抗原配制不准确，在血凝抑制试验前必须做抗原回归试验。抗原回归试验观察结果时，以前2孔完全凝集、后2 孔不凝集为准。若4 孔全部凝集，说明配制浓度过高；4 孔不凝集，说明配制浓度过低。只有在抗原回归试验成功的情况下，才能进行下一步的血凝抑制试验。

6 血凝抑制效价的判定

观察血凝抑制试验结果时，将反应板倾斜45°，从反应板背侧观察红细胞有无呈泪滴样流挂，以能完全抑制红细胞凝集的最高血清稀释倍数判为该血清的血凝抑制效价。

7 试验后的整理和消毒

试验结束后，将此次试验记录及操作过程中出现的问题进行归纳整理，做好仪器、设备的清洁消毒工作。先将96 孔V 形微量反应板用流水冲洗一遍，然后放入清洁液中浸泡数小时，再取出用流水冲洗干净，接着用生理盐水或蒸馏水再冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烘干，供下次使用。虽然移液器吸头可以循环利用，但清洗容易有残留，一般做集中回收进行无害化处理。使用过的器械、设备进行原处归位，做好日常管护，为下次试验成功做好预准备。