肝素纳米药物的研究进展*

孙佳静，万江陵，杨祥良，李子福

(1.华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074；2.国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430074)

近年来，纳米技术不断革新与发展，在医药领域展现出广阔的应用前景[1]。由此衍生的纳米药物因具有更长的血液循环时间、缓控释放以及低毒副作用等显著优点而成为研究热点领域[2]。但纳米药物仍存在递送局限性，面临着肿瘤深部渗透困难且易在肝脏、脾脏等组织中聚集产生器官毒性等问题[3]。肝素是一种高度硫酸化、非均一的天然糖胺聚糖[4]，具有良好的生物相容性和亲水性，在临床上常用作抗凝血药物。肝素分子内富含可供进一步修饰的羟基和羧基，易于合成多功能两亲性衍生物。肝素及其衍生物可通过静电吸附或化学键合等方式对纳米药物进行表面修饰，从而提高药物的稳定性、水溶性，延长体内循环时间；也可作为纳米药物的骨架材料，实现对疏水性药物、蛋白质和基因治疗药物的有效递送。

肝素主要分为普通肝素(unfractionated heparin，UFH)、低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)以及一些改性肝素。相较于UFH， LMWH具有更长的半衰期、更好的皮下注射生物利用度以及良好的药动学行为[5]，因此在临床上有更为广泛的应用。肝素具有多种药理学功能[6]，①抗凝血作用：肝素的戊糖结构与抗凝血酶Ⅲ结合后，通过抑制凝血酶与凝血活性因子的活性实现抗凝作用[7]。②抗血栓作用：通过抑制血小板聚集，并促进组织纤溶酶原激活因子的释放与纤维蛋白的溶解[8]，从而减少血栓的形成。③抗炎作用：肝素能竞争性抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和P-或L-选择素之间的分子相互作用[9]，并下调趋化因子、转录因子[如核因子-κB(NF-κB)]和炎症因子[肿瘤坏死因子(TNF-α)]的活性[10]，抑制炎症细胞的黏附和组织浸润。基于这些特性，肝素在临床实践中被广泛用于各种适应证，这使得肝素纳米药物具备良好的临床转化潜能。此外，肝素还具有抗肿瘤血管新生和抗肿瘤转移活性，并能与体内多种蛋白质结合而具有潜在靶向性。基于肝素构建多样化的纳米载药系统，实现药物的靶向递送与协同抗肿瘤效果，以克服肿瘤多药耐药和免疫抑制等问题，有望用于黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等高转移性肿瘤的治疗。肝素优异的生物学特性使得其作为纳米药物载体材料具有广阔前景。

1 肝素作为纳米药物载体材料的优势

天然多糖具有安全性高、稳定性好和可降解等特点，且易于化学修饰与改性，如肝素、壳聚糖、透明质酸和羟乙基淀粉等，被广泛用于纳米载药系统的构建。然而，壳聚糖水溶性较差，经聚乙二醇亲水改性后又会造成药物的细胞摄取减少和降解困难等问题[11]；透明质酸虽能提高药物对肿瘤细胞的选择性[12]，但易在肝肾部位聚集而产生毒副作用；羟乙基淀粉和肝素都具有良好的亲水性和生物相容性，但肝素还具有其独特的天然优势：①抑制血管生成介导的抗肿瘤活性；②抗肿瘤转移活性；③肿瘤靶向性。

1.1抗肿瘤活性 肿瘤的生长与发展依赖于异常的血管生成系统。血管生成由多种生长因子共同调节，例如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)。这些生长因子与存在于内皮细胞和细胞外基质的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPGs)结合，促进内皮细胞的增殖和迁移。肝素(尤其是LMWH)通过肝素结合域和多种生长因子相结合[13]，竞争性抑制生长因子与其内皮受体的结合，从而减少bFGF和VEGF诱导的血管生成，发挥抗肿瘤活性。

熊果酸(ursolic acid，UA)、藤黄酸(gambogic acid，GA)、槲皮素(quercetin ，Qu)等天然产物具有广泛的抗血管生成活性，但水溶性差和不稳定性限制了它们的应用。通过化学偶联将肝素与这些抗血管生成药物相结合[14-16]，能产生协同效应，提高药物的抗血管生成活性与抑瘤效果。TIAN等[17]以LyP-1肽为靶向配体，开发了LyP-1-LMWH-Qu(PLQ)偶联物用于包封和输送GA。该系统将多种抗癌药物靶向共递送至过表达p32的肿瘤细胞和肿瘤周围淋巴管，实现靶向化疗与抗血管生成治疗的联合，为逆转乳腺癌的多药耐药和转移提供了协同策略。

1.2抗肿瘤转移活性 VEGF-C及其受体VEGFR-3对调控淋巴管生成有重要作用[18]，两者结合后产生的信号级联反应能诱导淋巴管生成、淋巴管内皮细胞的增殖、迁移和管状形成[19]。肝素可以通过阻断VEGF-C信号通路来抑制淋巴管生成，从而降低肿瘤转移发生率。此外，肝素与P-和L-选择素有良好的亲和力，因此能竞争性抑制选择素与相关配体的结合，从而抑制选择素介导的肿瘤细胞与血小板的粘附，减少肿瘤细胞的转移与侵袭[20]。肝素还能破坏肿瘤细胞肌动蛋白应激纤维的组织，并阻碍血小板与肿瘤细胞的相互作用，从而阻碍血小板诱导的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，抑制肿瘤的转移[21]。

LONG等[22]构建了苯硼酸(PBA)-低分子量肝素(LMWH)-生育酚琥珀酸酯(TOS)自递送纳米胶束(PLT NPs)，用于抑制肿瘤转移级联的不同位点。体内试验表明，未载药胶束在黑色素瘤、乳腺癌及结肠癌转移模型中都显示出极强的抗转移作用，而载阿霉素胶束在PBA的靶向作用下具有更强的抗肿瘤及转移作用，有望成为术前及术后预防和治疗肿瘤转移的有效疗法。后续的研究证明，该胶束中的亲水段LMWH可以通过抑制P-选择素及其配体介导的血管内皮细胞与粒细胞样髓源抑制性细胞 (G-MDSCs)之间的粘附，阻断G-MDSCs的外渗与早期肺聚集，从而防止转移前微环境的形成，发挥抗肿瘤转移作用[23]。

1.3肿瘤靶向性 肝素与肿瘤部位丰富的的血管内皮细胞和血管生长因子具有较强的亲和力，因此肝素及其衍生物具有天然的肿瘤靶向性，有利于药物在肿瘤部位的富集。HU等[24]采用脂质体融合技术制备了米托蒽醌(MTO)-泼尼松龙(PLP)共包载脂质体，再利用低分子肝素-脱氧胆酸偶联物(LHD)作为靶向配体。实验表明，LHD增强了药物在体内的肿瘤靶向性，使得该脂质体在黑色素瘤和结肠癌模型中表现出更好的抑瘤作用。

2 肝素用于纳米药物的表面修饰

肝素是一种带有负电荷的内源性多糖，可通过静电吸附或化学键合等方式对纳米药物进行表面修饰，从而发挥以下作用：①提高药物的水溶性；②抑制蛋白调理，减少网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)的吞噬，延长药物在体内的循环时间；③屏蔽纳米粒的正电荷，阻止颗粒聚集，提高纳米粒的稳定性并降低毒性；④肝素具有抗凝、抗肿瘤生长及转移活性，能协同多种治疗组分发挥更强的抑瘤效果。

2.1用作成像对比剂的稳定剂 超顺磁性氧化铁纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)比表面积大、分散性好，是磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)中常见的对比剂，但其在生理环境下及磁场中易发生聚集，滞留于正常组织中造成长期毒性。利用肝素对其进行表面修饰后，能提高对比剂的稳定性和对比强度，降低毒性。

肝素及其衍生物修饰的SPION主要用于T2加权MRI。相比于右旋糖酐、壳聚糖修饰的SPION，肝素因能与细胞外基质环境中含有肝素结合域的各种蛋白质相互作用，而提高了纳米粒的细胞摄取。XIE等[25]先将肝素与琥珀酸酐进行酰化反应，再涂覆于SPION表面制得SU-HP-SPION，其T2弛豫率(460 mM-1·s-1)为临床Feridex®(98.3 mM-1· s-1)的4.68倍，在异种移植瘤T2MRI中的性能相比合成的Feridex类似物提高了10倍，并表现出良好的合成再现性、溶液稳定性和生物相容性。SPION的涂层厚度和亲水性会影响r2值。因此，需对肝素进行适当修饰获得更丰富的且能柔性连接的羧基，以取代SPION中疏水性表面配体实现两者的紧密结合，得到高效低毒的成像对比剂。

由于胰岛细胞的磁共振敏感性极差，其体内评估困难，且胰岛移植早期即刻经血液介导的炎症反应(IBMIR)会造成胰岛功能的损伤。利用具有抗凝活性的肝素对成像对比剂进行修饰可有效解决上述问题。HWANG等[26]制备了具有抗凝活性的肝素固定化超顺磁性氧化铁(HSPIO)纳米颗粒，用于体外胰岛细胞的表面修饰。实验结果表明，HSPIO纳米粒能成功标记胰岛细胞，并产生足够的信号强度，且不会通过非特异结合而蓄积在肝脏中，实现对移植到体内的胰岛细胞安全准确的定量检测。将磁共振敏感的HSPIO纳米颗粒稳定附着在胰岛细胞表面，能减弱注射胰岛细胞周围的IBMIR，提高移植胰岛细胞的存活率。肝素修饰的SPION在移植胰岛细胞成像方面有广阔的开发前景。

2.2用作阳离子载药系统的稳定剂 阳离子脂质体被广泛用于基因传递，但其会改变细胞膜电位、破坏细胞膜而产生细胞毒性。当阳离子脂质体进入血液循环时，它们与血液中带负电荷的血浆蛋白结合，导致聚集和沉淀。借助静电吸附作用完成肝素对阳离子载药系统的表面修饰，能屏蔽纳米粒的正电荷，提高纳米药物的稳定性。YU等[27]设计了一种LMWH包被的脂质siRNA复合物(LH-Lip/siBCL-2)来装载BCL-2siRNA。实验表明，LMWH的修饰显著减少了由阳离子脂质体引发的正常细胞的凋亡和坏死，且外部肝素易被肝素酶降解，从而减小siRNA转染的阻力。

此外，多肽、蛋白质等生物分子可通过自组装形成结构可调的纳米载体，可高效负载并递送疏水性药物与光敏剂。其中，阳离子肽分子如二苯丙氨酸二肽因其组装形式多样且易化学修饰而被广泛应用。应用肝素对该阳离子纳米载体进行修饰后[28]，有助于抑制体内蛋白吸附，延长纳米粒的循环时间，是光敏剂的理想载药平台。

2.3用于联合治疗 常规化疗不能充分抑制肿瘤转移，且多次给药可能导致全身毒性和耐药。而将化疗与免疫疗法相联合，同时利用有抗肿瘤转移活性的肝素对纳米粒进行修饰，能实现对肿瘤生长和转移的有效抑制。XIA等[29]以PEG-PAMAM为骨架材料负载药物DOX，再通过静电作用在其表面吸附以免疫佐剂CpG-ODNs和LMWH，形成了一个核壳结构的纳米递送系统。肝素通过影响肿瘤细胞中肌动蛋白的排列和抑制血小板诱导的肿瘤细胞EMT而表现出抗肿瘤转移作用，动物实验表明该纳米粒对原发性黑色素瘤及肺转移有明显的治疗效果，这为抑制肿瘤转移提供了有效的联合治疗思路。

3 肝素作为纳米药物的载体骨架

肝素是一种水溶性天然阴离子多糖，具有良好的生物相容性，且与多种蛋白质有较强亲和力，因此可作为骨架材料用于药物载体的构建，实现对疏水性药物、蛋白质、基因等生物治疗分子的有效递送。此外，肝素分子中存在大量的游离羟基、羧基和硫酸根，可用于连接各类功能分子，丰富纳米粒的功能。

3.1肝素-药物偶联物 肝素可用于构建可生物降解的两亲性多糖-药物偶联物，并自组装形成具有内核结构的核壳纳米粒，作为疏水药物的贮存器。MEI等[30]通过腙键将肝素与DOX偶联得到的两亲性HD-DOX具有酸响应释药特性并能在水中自组装形成核/壳结构。其半衰期为游离阿霉素的3.6倍，对黑色素瘤的转移具有明显的抑制作用。

肝素及LWMH羧基的疏水衍生化能极大提高肝素的抗血管生成活性，同时降低抗凝活性，减少出血风险[31]。阿霉素(DOX)和DNA碱基对间的π-π相互作用使得两者具有良好的亲和力。基于DNA的结构，YU等[32]构建了线粒体损伤KLA肽衍生物(mKLA)和抗血管生成LMWH-白杨素偶联物(LC)以模拟与DOX结合的双链，三者在水性环境中通过π-π堆积、疏水作用和静电作用，自组装形成稳定的纳米复合物LKD。DOX在多种超分子驱动力作用下“主动”载入纳米粒内核，载药量为一般DOX纳米制剂的3倍。该复合物进入肿瘤细胞后，DOX的质子化作用会“解锁”LKD，并通过抗血管生成、线粒体和DNA损伤的协同作用达到极强的抗肿瘤效果。

3.2纳米凝胶 纳米凝胶的网状结构有利于载体对药物的负载。肝素与带正电的生物活性物质具有较好的亲和力，能极大提高纳米凝胶对生物药物的负载效率。肝素与聚乙烯亚胺(PEI)通过化学交联制得纳米凝胶在基因治疗方面取得良好成果。SONG等[33]利用细胞穿膜肽R8接枝的PEI与肝素合成的纳米凝胶(HPR)可高效递送基因质粒phTRAIL。该系统通过抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡达到治疗效果，在转移性结肠癌模型中表现出良好的抗肿瘤活性。此外，肝素的屏蔽作用使其在保证高基因转染效率的同时，毒副作用大幅减少。

肝素也常与普朗尼克通过物理或化学交联以制备热敏性的纳米凝胶，用于负载治疗性蛋白质以及疏水性药物。LI等[34]将LMWH-普朗尼克共聚物与硅酸盐纳米粒子结合，制备了一种载DOX的热敏性水凝胶LR-HP。该纳米凝胶载药量高，具有缓释效果，且基于肝素和药物的协同作用，其在体内外均表现出优异的抗肿瘤作用，适用于局灶性肿瘤的治疗。

3.3聚电解质纳米复合物 聚阴离子肝素可自发地与聚阳离子物质发生相互作用而形成聚电解质复合物，用于不同理化性质药物的共递送。此外，该类纳米载体易实现电荷反转，有利于药物的细胞摄取和肿瘤部位的深部穿透。HUANG等[35]开发了一种酶响应纳米粒。通过肝素和鱼精蛋白之间的静电作用制备了聚电解质复合物，合成了PTX-DOTAP@alloferon-1-肝素/鱼精蛋白纳米系统，以实现疏水性药物PTX和亲水性allereron-1多肽的共包载，粒径为106.1 nm，Zeta电位为-45.1 mV。到达肿瘤部位后，细胞外基质中高表达的乙酰肝素酶-1识别并降解外层肝素并通过离子扩散作用释放包裹的alloferon-1，使纳米粒的粒径减小至59.30 nm，电荷变为25.4 mV。实验表明，该复合物对黑色素瘤具有良好的治疗效果，且不会引发对正常脏器的毒副作用。该纳米载药系统将化疗与免疫治疗相结合，共递送且逐步释放alloferon-1和PTX使其作用于不同靶细胞，解决了依次给药导致的肿瘤部位药物/蛋白质比例不可预测、半衰期短和全身不良反应等问题，为高转移性肿瘤的治疗提供了一个良好的纳米平台技术。

基于肝素的聚电解质纳米复合物也可用于核酸的高效递送与可控释放。NIE等[36]设计了一种具有核酸自促释放功能的纳米复合物Hep@PGEA，其中可解锁的负电性肝素纳米核(HepNP)由交联硫辛酸修饰的肝素制得，并通过静电作用与主-客组装引入阳离子聚合物PGEA层。该复合物进入细胞后，肝素纳米粒核心被解锁并与外层PGEA相互作用，促进壳层中缩合核酸的释放，有效地将miR-499和pVEGF导入心脏，抑制心肌细胞死亡，促进心脏修复。

4 结束语

肝素是一种可生物降解的聚阴离子天然多糖，具有优良的亲水性、生物相容性，且含有多个可修饰位点，因此可作为表面修饰分子或载体骨架用于纳米递送系统的构建。肝素还具备抗肿瘤血管生成活性、抗肿瘤转移活性和肿瘤靶向性等得天独厚的优势，使得肝素纳米药物极具发展潜力：①基于肝素及其衍生物构建纳米药物递送体系，通过共价结合、静电吸附等方式负载抗癌药物，或是将其与免疫制剂联用，可实现治疗组分肿瘤杀伤作用与肝素抗血管生成作用相协同的抗肿瘤效果，这为克服肿瘤多药耐药及癌细胞转移等问题提供了思路。②肝素分子内存在大量的羟基和羧基，易于修饰。通过pH敏感的腙键将肝素与药物相连，可实现智能响应释药；或是连接以荧光基团、光敏剂、靶向基团等功能分子，可实现药物的靶向递送、实时监测以及多种治疗方法的联合，提高治疗效果。③肝素带有负电荷，可以与带正电的蛋白质通过静电作用结合为纳米粒，或是与阳离子脂质相作用形成聚电解质纳米载体，从而运载蛋白质、基因等生物药物。基于此，可构建电荷反转和粒径变化的智能纳米药物，以实现药物在肿瘤部位的深部穿透。④肝素可被在恶性、高转移性肿瘤中高表达的乙酰肝素酶-1识别和降解，且肝素所具有的抗转移活性，使得肝素纳米药物对于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等高转移性肿瘤有着显著的治疗效果，在以上这些肿瘤的治疗中具有极大的潜能。

尽管肝素在纳米药物递送系统中发挥着越来越重要的作用，但目前尚无肝素纳米药物制剂进入临床试验。在肝素纳米药物的后续开发中，需要关注以下问题：①肝素有抗凝活性，因此可能诱发血小板减少症，造成出血风险。然而肝素结构与活性之间的确切关系还不够清晰，应对此进行深入研究。②纳米粒通常经胞吞进入细胞，相比小分子药物自由扩散的入胞方式，其细胞摄取效率较低。且肝素具有强的负电性，虽能延长药物在血液中的循环时间，但与细胞表面的负电荷互相排斥，会进一步降低药物的入胞效率。采用电荷反转与受体介导等策略，可以提高纳米药物的入胞效率。③异常的血管、淋巴管结构，致密的间隙基质，高间质液体压力，累积的固体应力等使得纳米药物向肿瘤核心的递送和渗透异常困难。通过将肝素分子内可修饰的基团与肿瘤靶向配体(如苯硼酸、叶酸、乳糖酸)及降解细胞外基质的蛋白酶(菠萝蛋白酶)等相连接，增强药物在肿瘤部位的渗透。④动物来源的肝素生产工艺复杂，质量控制难度大。需采取有效的监测方法以分析和控制肝素的质量，并开发新工艺制备肝素，保证肝素的安全性。而肝素纳米药物在临床转化上还存在工艺放大困难、体内安全性评价复杂性等问题[37]，需要建立更科学全面的药理、毒理学评价方法和质量评价指标。