蛋白质组学在系统性血管炎中的研究进展

蔡昕添 吴 婷 李南方

系统性血管炎是一组原因不明的、以血管壁和(或)管壁周围组织炎症和坏死为基本病理改变的结缔组织疾病，根据受累血管类型、位置、病理特征等情况的不同，可导致相应的组织和器官出现缺血的表现，临床上常表现为皮肤破坏、多部位关节炎甚至多脏器衰竭。目前，系统性血管炎的诊断主要依靠患者的临床表现、影像学检查、病理活检、动脉造影以及结合实验室检查检测到的一种或多种自身抗体来确定[1]。然而，目前临床常用的诊断方法其效率与准确率均不高且存在一定的局限性。生物学标志物虽早已应用于临床之中，且为非侵入性检查，对患者伤害小，可反复进行。但目前仅少数生物学标志物可用于系统性血管炎的诊断，如抗中性粒细胞胞质抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)对于ANCA相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)的诊断具有重要临床价值，但对于病情评估尚存争议；如红细胞沉降率和C反应蛋白等炎性生物学标志物，但其特异性较差，无法区分血管炎与感染[2]。这些标志物或许有助于系统性血管炎的诊断，但对疾病活动与复发的评估价值并不大。因此，寻找新型诊断及评估病情变化的特异性生物学标志物，以期更早制定出新型的治疗方案，提高系统性血管炎患者生存率和生活质量，是临床亟待解决的重大问题。

蛋白质组学作为一门新兴的科学和技术，已受到众多学科的广泛关注，成为当下的研究热点。目前，蛋白质组学技术广泛应用于肿瘤、心血管疾病及自身免疫性疾病的研究之中，对深入探究疾病发生、发展机制、早期筛查与诊断、个性化治疗、预后评估都有着极其重大的意义[3]。它的发展完善为系统性血管炎的研究带来了全新的思维模式，开拓出全新的研究领域，对探讨系统性血管炎发病机制、早期诊断和治疗及改善预后具有重大意义[4]。本文通过查阅国内外相关文献对蛋白质组学及其在系统性血管炎，尤其是在巨细胞动脉炎、川崎病、ANCA相关性血管炎、白塞病、过敏性紫癜中的研究进展做一综述。

一、蛋白质组学

蛋白质组学是应用多技术对特定生物液体、细胞或组织内所表达的全部蛋白质进行鉴定，并分析其表达水平及修饰状态，研究其结构、功能以及相互作用。通过蛋白质组学技术的研究，不仅能了解疾病发展的物质基础，还能为疾病机制的阐述及疾病的攻克提供可靠的理论依据和有效的解决途径。

二、蛋白质组学技术在系统性血管炎中的应用

1.巨细胞动脉炎：巨细胞动脉炎(giant cell arteritis，GCA)是一种肉芽肿性大血管炎，常影响主动脉及其主要分支，尤其是颞动脉。其临床表现可因受累部位不同而表现复杂，甚至出现失明等严重并发症。因此，早诊和早治是预防这种疾病发生不可逆损害的关键[5]。Alexis等[6]采用2-DE联合MS技术将GCA患者颞动脉活检分离得到的血管平滑肌细胞(vessel smooth muscle cells，VSMCs)与来自健康对照组的VSMCs进行差异蛋白质分析，结果发现26种差异蛋白，其中内皮素-1(endothelin-1，ET-1)被认为是GCA中VSMCs增殖的关键激活物，这也再次证实此前Planas-Rigol等[7]所得出的结论：ET-1在GCA血管病变中显著上调，并通过促进VSMCs向内膜层迁移，进一步加重GCA中血管内膜增生和血管闭塞情况。以上研究表明ET-1等蛋白质对于GCA的诊断及病情预后判断可能具有较大的提示价值。ET-1是内皮素家族的成员之一，内皮素家族成员(主要包括ET-1、ET-2和ET-3)都是由21个氨基酸组成的活性多肽，是目前已知最强的缩血管物质之一，参与多种疾病的病理生理过程。而ET-1是唯一存在于内皮细胞的内皮素，除有收缩血管作用外，还可介导血管内皮损伤及刺激血管平滑肌细胞增殖。近年来多项研究表明其参与了多种系统性血管炎的发病机制[8]。然而，其特异性与敏感度仍有待于进一步开展大样本队列研究予以证实。

2.川崎病：川崎病(kawasaki disease，KD)是一种婴幼儿时期常见的急性系统性血管炎。它主要累及中、小血管，并可导致一系列心血管系统的严重并发症[9]。为寻找诊断KD的新型生物学标志物，Alex等[10]运用蛋白质组学技术分析了KD患者与高度怀疑KD但最终证实为其他发热性疾病患者的血清和尿液，发现两种免疫调节相关分子仅在KD患者尿液中高表达，包括金属蛋白酶Meprin A和细丝蛋白C。更有意义的是，研究者利用前瞻性盲法研究验证了这两个指标，最终在不同队列中再次证实KD患者血清与尿液中Meprin A和细丝蛋白C水平显著高于对照组。并且与目前常用的实验室检查比较，这两种标志物对于症状不典型KD均表现出更为优异的诊断效能。此外，Yayoi等[11]采用LC-MS/MS技术比较了急性期与恢复期KD患者的血清蛋白质，结果显示急性期患者血清中LBP、LRG1和AGT的表达水平显著高于恢复期患者，而急性期患者血清中RBP4的表达水平则明显低于恢复期患者。这提示以上蛋白可作为预测KD活动性的潜在生物学标志物。目前，临床上KD治疗最常用、最有效的方案仍为口服阿司匹林和大剂量静脉注射丙种球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)联合[12]。然而IVIG存在众多不良反应，甚至是致命性的不良反应，如急性肾衰竭和血栓栓塞，所以评估该方案是否利大于弊是极为必要的[13]。Zhang等[14]采用2-DE和MALDI-TOF/TOF-MS对IVIG治疗前后的患者血清进行蛋白质差异表达分析，共鉴定出29种差异表达的蛋白质，其中最有价值的蛋白质是转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)。KD患者的TTR水平显著高于健康对照组，且IVIG治疗起效后，TTR可恢复到正常水平，但在IVIG治疗无效的患者中TTR并没有这种变化，这或许可作为评估KD患者IVIG疗效有无的潜在指标。

3.ANCA相关性血管炎:AAV是一系列以坏死性炎性反应为特征的小血管炎。ANCA是目前诊断AAV最常检测的血清标志物，但并非所有AAV患者都能检测到ANCA，且ANCA的血清水平并不总能准确反映AAV的活动度[15]。因此，需要寻找更多的生物学标志物用于AAV的诊断及其活动度的评估。此外，因AAV常同时累及多脏器，所以发掘能反映特异性器官损伤的生物学标志物也尤为重要。Régent等[16]采用13C/15N标记结合LC-MS/MS的方法对健康者和AAV患者治疗前(活动期)与治疗后(缓解期)的血清进行蛋白质差异表达分析，共鉴定出多种差异有统计学意义的表达蛋白质。并在另一更大样本量的AAV患者队列中对以上蛋白质进行了敏感度与特异性的分析鉴定，最终选定组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)为监测AAV活动的最佳生物学标志物，这一结论也证实了Bjerkeli等[17]的研究结果，活动期GPA的TIMP-1水平显著高于非活动期与健康对照组。

Rani等[18]采用2-DE和MALDI-TOF-MS分析了GPA活动期患者、缓解期患者以及健康对照3组间血清中的差异表达蛋白质。研究结果显示与缓解期及健康对照组比较，活动期患者血清中发现了多种差异表达蛋白质。其中触珠蛋白可能是反映GPA疾病活动最重要的标志物。维生素D结合蛋白、CD91和IL-17可用于活动期与肾损伤的监测。以上几种蛋白质均可用于诊断和预后判断，但其实际的临床价值仍有待于进一步评估。

4.白塞病：白塞病(Behcet′s disease，BD)是一种变异性血管炎，可累及全身各处血管，当累及中枢系统、泌尿系统等重要脏器时常致死致残。为应对这一挑战，Hu等[19]利用血清标本，采用了Hu-Prot技术分别分析了BD、大动脉炎、ANCA相关性血管炎、干燥综合征和健康受试者中差异表达的蛋白质，并通过更大样本量的队列进行了验证，发现抗-CTDP1抗体在BD患者中的表达明显高于疾病对照组和健康对照组。此外，Cheng等[20]通过LC-MS/MS分析了BD患者血清同其他风湿免疫性疾病、健康对照之间差异表达的蛋白质，从BD外周血循环免疫复合物中鉴定出多种自身抗原。并针对自身抗原微管蛋白-α-1c的自身抗体进行了进一步的研究，发现它在BD中表达显著增高，这或许是一种全新的BD诊断标志物。研究者还发现抗微管蛋白-α-1c自身抗体与深静脉血栓形成等并发症密切相关，而且其血清水平与BD活动度呈正相关。但研究者尚不清楚是抗微管蛋白-α-1c抗体导致了内皮细胞损伤及局部血管炎性反应，还是血管炎性反应诱导产生了抗微管蛋白-α-1c抗体。所以有必要进一步研究微管蛋白-α-1c及其自身抗体在BD中的发病机制。

5.过敏性紫癜：过敏性紫癜(henoch-schonlein purpura，HSP)是一种由IgA介导的小血管炎，又名IgA血管炎(IgA-vasculitis，IgAV)，通常涉及皮肤、关节、胃肠道以及肾脏，其中肾脏受累者(IgA vasculitis with nephritis，IgAVN)预后往往极差。目前为止，尚无明确的实验室检查能用于确诊HSP[21～23]。孙秀坤等[21]通过CM10芯片结合SELDI-TOF-MS技术，分析了HSP伴发肾炎患者与HSP不伴肾炎患者尿液中的差异表达蛋白质谱，并利用SVM算法建立由多个标记蛋白构成的IgAVN的早期诊断模型，这些标记蛋白能在尿检发现隐血、尿蛋白之前即可测得，这为IgAVN的早期诊断提供了可能。当然该模型的稳定性与可重复性仍有待于不同队列的进一步验证。

He等[22]纳米级超高效液相色谱-质谱(nano LC-MS/MS)研究了IgAV、IgAVN和健康受试者之间在血清中差异表达的蛋白质，并通过ELISA进一步验证了其中丰度差异较大的蛋白质，如血管紧张素原和激肽原-1等。最终，研究者发现血清中血管紧张素原浓度与IgAVN发病密切相关，且其可作为判断IgAV预后的潜在标志物。Mao等[23]研究也发现尿血管紧张素原浓度可用作判断IgAV肾脏受累严重程度的潜在生物学标志物，并认为尿血管紧张素原水平的升高很可能直接参与了IgAV急性期肾损害的疾病进展。研究者还推测阻断尿血管紧张素原的生成可能是治疗重症IgAV肾脏受累的一种有效方法。

三、展 望

由于系统性血管炎治疗难度大且预后较差，因此尽早诊断是改善系统性血管炎患者预后的关键。鉴于目前系统性血管炎早期检测手段的局限性，研究者一直在找寻其敏感度及特异性更高的早期诊断标志物。近年来，蛋白质组学的飞速发展为系统性血管炎的研究提供了全新思路。为揭示系统性血管炎发病机制及寻找早期诊断、疗效评价和预后评估的可靠生物学标志物提供了极大的便利。但蛋白质组学技术在系统性血管炎的研究中仍存在无法回避的缺陷，如目前已发现的生物学标志物仍面临难以大规模应用于临床实践、检验检测流程仍未制定出标准化的规范和后期质控标准存在较大差异等困境。即便如此，随着蛋白质组学理论研究的持续深入、系统性血管炎中蛋白组学研究数据的不断积累以及实际实验操作流程的逐步改进，这必将带动系统性血管炎相关研究更进一步地发展。