神经毒素诱导帕金森病动物模型的研究进展

孙 雪 梁建庆 何建成 马利芳

帕金森病(parkinson disease，PD)是一种以静止性震颤、肌强直、运动减少及体位障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病。黑质-纹状体多巴胺(dopamine，DA)能神经元的进行性丢失和胞质内路易小体(Lewy body) 的形成是PD主要病理改变[1]。目前，PD确切的病因病机尚未可知，而随着PD发生率的不断攀升，该领域的研究备受人们关注。论及PD的研究必离不开实验动物模型的制备。PD的动物模型主要分为神经毒素模型和转基因模型两大类。神经毒素模型作为PD经典模型，主要针对DA信号模拟PD大部分病理和表型[2]。与基因模型比较，神经毒素动物模型病理机制更加清楚，造模方法更加完善。遗传基因动物模型的制备不仅复杂耗时且极易产生不良反应[3,4]。各种动物模型的制备都是模拟PD部分病理改变，有其各自的优势和局限性。本文针对国内外PD神经毒素实验动物的制备方法及相关原理进行综述，以期能进一步了解PD病理过程，为科研实验提供最优方案。

一、6-羟基多巴胺损伤动物模型

6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)是特异性的儿茶酚胺能神经毒素。6-OHDA虽受血-脑脊液屏障阻挡，但其对DA质膜转运蛋白具有高亲和力，可通过触发氧化应激相关细胞毒性和小胶质细胞依赖性DA神经元炎症，发挥毒性作用[5]。

1.作用机制：目前6-OHDA神经毒素作用的确切机制并未完全明了，已有研究表明6-OHDA的机制与氧化应激和抑制线粒体呼吸链有关。6-OHDA可与DA转运体结合进入黑质纹状体DA能神经元，经过多重氧化，最终损伤细胞。6-OHDA还可通过抑制线粒体呼吸酶复合体，阻断电子传递链，增加氧化应激，导致线粒体呼吸链被抑制，最终细胞内ATP耗尽引起细胞死亡[6,7]。

2.6-OHDA损伤动物模型：6-OHDA因受血-脑脊液屏障阻碍，造模需要脑内注射。脑内注射为立体定向注射，注射部位多为黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)、纹状体(corpora striate，CS)、中脑腹侧被盖区(ventraltegmental area，VTA)、前脑内侧束(medial forebrainbundle，MFB)，通常采用单点或双点注射法来制备单侧或双侧损毁的PD模型[8]。6-OHDA的剂量、浓度及损毁位点的选择都会影响PD模型的最终呈现。

3.6-OHDA损伤动物模型优劣性：6-OHDA的单侧损毁方法成熟简单，存活率高，模型评价方法简便。模型动物腹腔注射阿朴吗啡(或苯丙胺)不自主的向健侧(或伤侧)旋转运动行为可评估6-OHDA对黑质DN损伤程度。单点注射常用方法主要包含SNc、CS、VTA、MFB位点的注射，这些方法各有优缺点。SNc的单点注射可以根据6-OHDA注入内部剂量的多少，而相应制作出急性完全和部分损伤的模型。这种方法的劣势为SNc的范围小，定位困难，成功率较低，且难以区分最后的结果是毒性损伤还是机械损伤造成[9]。CS分布广，易定位，DA能神经元末梢吸收6-OHDA后，发生逆行性变性，从而破坏中脑黑质DA能神经元[10]。VTA是制备PD模型的重要靶点，注入后可增加大鼠模型旋转强度，方法简单易成功，但与人类PD病理特征不相符[11]。MFB的位置较深，定位困难，易发生变异，成功率较低。MFB多点注射可以提高造模的成功率，缩短周期，广泛的浸润损伤可以大量破坏DA能神经元，模拟出中晚期症状。此方法虽然提高了模型的稳定性和成功率，但其损伤重并不完全符合发病机制。6-OHDA的注射剂量决定模型DA纹状体通路病变及纹状体DA的显著下降程度[12]。综上所述，6-OHDA模型的优势主要表现在绝佳的评估方法上，通过一侧损毁，出现对侧行为症状来评断模型成功与否。其劣势为病死率较高，不能完全模拟PD的发病机制。

二、1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶动物模型

1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(1-methy l-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydoyndine,MPTP)是一种本身没有毒性的脂溶性有机化合物，其能通过血-脑脊液屏障。MPTP在大脑中代谢产生有毒物质1-甲基-4-苯基呲啶离子(MPP+)，引起毒性机制。

1.作用机制：MPTP作为高亲脂性化合物，能有效地透过血-脑脊液屏障。在脑内，先是被细胞线粒体外膜的单胺氧化酶B(MAO-B)催化变成中间代谢产物1-甲基-4苯基-2,3-二氢呲啶离子(MPDP+)，后自发氧化成毒性的MPP+。MPP+的结构与DA类似，能够与多巴胺能转运体(DAT)高度亲和，被纹状体内多巴胺能(DAG)神经元轴突末梢突触前膜的DAT运载进入胞体内[13,14]。

2.MPTP动物模型优劣性：MPTP的PD动物模型会因不同的给药方式、给药时间呈现出不同的病理特征。MPTP动物模型通常采用腹腔内注射、皮下注射、静脉注射的方式制备。这种给药方法操作相对简便易行，模型代表性好，成功率也高。目前MPTP最常用的PD动物是小鼠动物模型，因其病理生理机制与PD吻合度较高，备受青睐。各种PD小鼠模型根据注射剂量、间隔时间、方式以及时间长短的不同来制备不同研究目的模型，主要分为急性模型、亚急性模型和慢性模型[15]。急性模型是采用腹腔或皮下注射，间隔时间短，建模速度快，损伤严重，但其模型并不符合PD慢性发病的特点，并且这种建模方法并非神经元慢性凋亡而是快速损伤坏死，病死率相对较高。亚急性模型同样也采用腹腔注射或皮下注射的方式，间隔时间较急性长，建模速度一般，成活率较高，损伤比急性轻，并且具有PD一定的发病特点，DAG神经元有部分凋亡。亚急性模型的缺点是损伤时间比急性模型长，病理机制与PD患者慢性发病机制差别比较大，其损伤的DAG神经元有部分凋亡的同时还有大量坏死[16]。经目前研究表明，不管是急性还是亚急性，都只是一个短暂的对于黑质-纹状体神经元容易发生逆转的神经毒性作用，这种快速的方法无法与缓慢、渐进性的PD相匹配[17]。慢性模型除了给药时间间隔长，其病死率非常低，症状典型稳定，且病理损伤过程稳固不易恢复，与PD的病理生理过程相符合。综上所述，不管哪种MPTP方案都只能是部分模拟PD的病理机制，完全模拟PD的运动障碍仍存在困难。

三、鱼藤酮动物模型

鱼藤酮是属异黄酮家族的一种植物性杀虫剂。研究表明，用鱼藤酮染毒可诱发动物出现运动迟缓、僵直、震颤等类似PD的典型临床症状；用鱼藤染毒小鼠在黑质纹状体的细胞中也可出现α突触蛋白(α-synuclein) 聚集和DA神经元的丢失现象[18]。

1.作用机制：目前关于鱼藤酮导致PD的发病机制还不是十分清晰，尚认为其可能主要从细胞凋亡、细胞自噬、神经炎性反应方面导致PD的发生[19]。鱼藤酮的脂溶性，可通过血-脑脊液屏障及生物膜，继而选择性地与线粒体复合物Ⅰ结合，破坏氧化磷酸化，诱发氧化应激，从而发挥细胞毒性作用。

2.鱼藤酮动物模型优劣性：鱼藤酮PD大鼠动物模型最大的优势为PD模型行为学改变和病理学特征均与临床PD相似。鱼藤酮模型的慢性暴露方式在病理、生化等各方面均能较好地模拟PD相关特征[20]。但鱼藤酮的全身毒性致使PD动物模型存在成模率低、成本高、方法复杂等缺点。鱼藤酮模型给药方式较多，优劣各异。脑立体定位给药的造模方法较难，需定位准确，但其病死率低，成功率高。静脉给药方式的存活率相对其他大剂量的存活率高，方法简单，药物直接进入全身循环，但全身毒性大。腹腔注射造模，吸收面积大，成模率高，操作简便，不仅症状与PD患者相似，且能制备PD的胃肠功能障碍模型[21]。皮下注射的方式更为便捷，成本低，成模率高，但皮下注射会引起大鼠全身毒性，导致较高病死率，且不符合PD病变特点。口服造模符合PD慢性进行性病程，还避免了外周毒性，该方式病死率低，成模率高，适于研究PD病机病程变化及治疗药物的作用机制。鱼藤酮动物模型更符合PD病理进程，黑质-纹状体通路及肠道神经元均出现路易小体，其明显的劣势为动物病死率过高。由此可见，对于选择鱼藤酮造模方法要根据实际操作进一步选择。

四、百草枯动物模型

百草枯(paraquat，PQ)是一种与MPP+结构相似，与MPTP神经毒性相似的快速灭生性除草剂。百草枯机制尚不明确，但其可通过血-脑脊液屏障到达黑质纹状体系统，选择性地破坏黑质致密部DA能神经元，最终产生类似于PD的症状[22]。

1.作用机制：百草枯是PD病因的外源性神经毒素，长期低剂量暴露于百草枯会造成DA能神经易损。PQ的神经毒性机制尚不明确，但就目前研究认为可能是：①激活星形胶质细胞合成和释放致炎细胞因子：细胞外基质降解加速神经元损伤及毛细血管基膜胶原成分降解破坏血-脑脊液屏障增加通透性，最终脑损害加重；②氧化应激：自由基作用形成过氧化物，对DNA和蛋白质产生氧化损伤；③抑制线粒体功能。黑质和纹状体中线粒体功能障碍，致使细胞凋亡加速加重，黑质区TH神经元数目减少，甚至脑组织有坏死空腔形成。

2.百草枯动物模型的优劣性：百草枯动物模型的制备主要是模拟了人类暴露于百草枯的方式。这种方法更符合环境因素诱发的PD患者。商用百草枯水剂成本低，实验周期长，符合PD慢性进程的特点。这种模型制备方式若单纯使用百草枯造模会导致小鼠病死率增高，同时加上抗纤维化的药物会使模型更易制备。但部分实验用百草枯造模时并未提及它致死率的高低，以及造模时是否有必要给予抗纤维化的药物用以预防其毒性不良反应的发生，其科学性与可行性有待讨论[23]。腹腔、脑内或皮下注射以及口服百草枯的方法均可制备百草枯PD模型。单次或短期较高剂量多次注射百草枯可诱导出神经元坏死的模型，但这种方式与长期暴露于百草枯的致病方式相悖，且这种百草枯试剂价格昂贵。脑内注射需借助脑立体定位仪，模型成功率较低，过程复杂，有一定技术难度。口服百草枯的制备方式更加符合人类的主要经口暴露方式，但这种方式建立PD模型的研究国内报道较为罕见。而口服百草枯造模和腹腔注射百草枯造模两者间比较, 腹腔注射造模效果更好，行为学改变更为显著。所以运用百草枯动物模型的具体方法要根据实际试验操作慎重选择。

五、展 望

4种神经毒素诱导的PD动物模型各有所长。不同的造模方法、给药方式及剂量均会影响模型作用机制与实验结果，建立一个稳定、成功率高、简便易行的模型是构建PD模型亟待解决的问题。目前PD的致病因素和发病机制尚不明确，但基因突变、环境等多种致病因素与PD密切相关。神经毒性药物模型在PD的相关研究中具有广阔前景，但现在所掌握的模型制备方法都没有PD明显的病理改变，仅有局限的生化反应，想要模拟出完备的PD动物模型仍需要进一步探讨研究。相信在未来，PD动物模型能完全符合PD这一神经系统的慢性疾病的自然进程。随着PD“基因时代”的来临，基因模型尚未被证实是否复制了PD的大部分主要特征，但神经毒素和基因模型的结合对于挖掘人类PD机制与治疗不可或缺，值得深入探讨。